生物分子中相互作用检测方案(大分子作用仪)

SARTORIUS 蛋白与蛋白Science关键词：艰难梭菌，毒素 B， Wnt 受体， Frizzled 蛋白 专 S12D2/LS OCTET 生物层干涉技术应用文集 Simplifying Progress Bio-LayerInterferometry(BLI) Application Booklet SARTORILS 赛多利斯集团成立于1870年，总部位于德国哥廷根，是国际领先的生命科学研究和生物制药行业合作伙伴。集团的实验室产品及服务部门为生物制药企业以及各类科研机构提供创新的实验室设备及产品，以满足客户开展高端科研实验和严苛的质控需求。集团的生物工艺解决方案部门提供全套的生物制药设备，并专注于一次性解决方案，帮助客户安全高效的生产生物药品和疫苗。截至到2020年底，集团拥有11，000 多名员工，60多个生产和销售基地，服务于全球用户。 Octet@分子相互作用技术平台包括仪器、生物传感器和相应试剂盒，是一种无标记的、实时监测的先进技术，主要用于生物分子间相互作用动力学参数以及蛋白浓度的测定。该平台通过浸入即读的检测方式(Dip and ReadTM)来提高检测通量，简单易学并有利于优化操作流程，使用户能在数分钟内就可以获得大量的可靠数据。在很多应用领域中，这种技术平台可以有效地替代ELISA、HPLC以及 SPR等分析方法。 生物分子间的相互作用是所有生命现象发生的基础，研究其相互作用可以阐明生物反应的机理，揭示生命现象的本质。2016年，国家自然科学基金"十三五"发展规划正式发布，明确了生命科学部的优先发展领域，第一部分即为：生物大分子的修饰、相互作用与活性调控，主要研究方向包括：生物大分子修饰、动态变化及其功能；生物大分子相互作用的动态性和网络特征；生物大分子特异相互作用的结构基础和预测等。生物分子包括核酸、蛋白、肽类、脂类、小分子、天然产物提取物、病毒等等，而研究这些生物分子的相互作用并了解它们的作用机制和功能机理是当前生命科学研究的热点。 关注赛多利斯实验室 分子相互作用分析仪采用生物层干涉技术，是当今世界上先进的生物分子检测仪器之一。它基于生物层干涉原理，通过监测生物传感器表面的生物分子结合所带来的膜层厚度变化来检测分子间的相互作用的动力学变化或浓度数据。该系统在生命科学领域的应用非常广泛： 3、小分子药物及中药天然产物提取物的筛选和鉴定：快速、准确的筛选与靶蛋白相互作用的小分子药物； 4、抗体筛选：应用于抗体库中抗体的筛选或是多克隆抗体的表位配对，尤其是针对低亲和力或是解离非常快的抗体； 5、DNA/RNA等核酸与蛋白的相互作用分析：基因调控、转录机制研究； 1、蛋白质相互作用全面分析：在蛋白组学中研究蛋白的功能，信号转导中研究信号通路等； 6、病毒颗粒与蛋白的相互作用等。 2、肿瘤机制研究：直接对临床标本、组织，细胞匀浆等复杂标本进行分析，对肿瘤标记物进行筛选鉴定； Octet@平台应用 竞争|抑制分析 DNA|RNA结合蛋白 病毒|疫苗 配体结合分析 糖型分析 生物工艺 小分子 结合动力学 生物仿制药 目录 生物层干涉技术(Bio-Layer Interferometry)原理介绍· 1 BLI动力学实验流程..... 2 BL1定量实验流程·....... 2 BLI技术应用展示… 3 3.1信号转导研究........ 4 3.2结构功能研究 6 3.3致病机理研究· / 3.4结构功能研究 8 3.5酶切活性研究........ 9 .3.6蛋白复合物研究· 10 3.7致病机理研究........ 11 3.8膜蛋白研究........... 12 3.9垂钓未知分子….. 13 3.10垂钓中药有效成分. 14 3.11 DNA-蛋白相互作用研究 15 .3.12 RNA-蛋白相互作用研究· 16 3.13核酸适配体(Aptamer)研究........... 17 3.14小分子化合物筛选·....... 18 3.15先导合合物的验证和表征 19 3.16天然产物/中药的研究 21 3.17肿瘤靶向ADC药物研究· 22 3.18G蛋白活性调控研究· 24 3.19低氧应答研究·........ 25 3.20细菌感染机制研究· 26 3.21抗病毒活性分析··........ 27 3.22耐药性研究.......... 28 3.23流感病毒研究.…....... 29 3.24埃博拉病毒研究 30 3.25细菌与抗体互作· 31 3.26细胞与分子互作·.......... 32 3.27定量检测方法… 33 3.28纳米材料.·...... 34 3.29表面化学研究… 35 选择适合的Octet@系统 36 生物传感器选择指南…· 38 5.1通用传感器 38 5.2抗体传感器 39 5.3标签融合蛋白类传感器 41 5.4 Dip and ReadTM检测试剂盒 42 生物层干涉(BLI)是一种非标记技术，它将发生在 BLI生物传感器表面的光干涉信号转化为实时的响应信号。通过对分子结合过程的实时监测，系统会测定结合常数(ka或 kon)和解/离常数(kd 或 koff)， 以及起始结合速率，并通过拟合计算分析得到亲和力(KD)和浓度信息。 Octet@生物传感器由玻璃光纤制成，并在玻璃光纤的末端外加了特殊的光学层。该光学层为配体的固定提供了表面化学基质(Figure 1)。白光(包括可见光谱中的所有波长)被引入玻璃光纤中，并在顶端的两个界面处产生部分内部反射：(1)玻璃光纤和光学层之间(恒定)的界面；(2)表面化学和溶液(可变)接触的界面(Figure 2A)。这两个界面产生的两路反射/光会引发光干涉现象(Figure 2B)，仪器会对每个波长的干涉光强度予以测量记录，并生成干涉光谱曲线(Figure 2C)。经历相长干涉的波长在光谱曲线上显示为高振幅，而经历相消干涉的波长则显示为低振幅。 Octet@相互作用分析仪就是通过实时测量干涉光谱曲线的变化，以实现检测分子间相互作用的目的。 Figure 1. Anatomy of a BLI biosensor. 当分子与固定在生物传感器表面上的配体结合时，引起光学/层的厚度增加，第二路反射光的路径长度比之前更长(Figure2D)。这导致干涉光谱曲线发生改变，并向右产生位移。当分子和配体解离时，分子会从生物传感器表面解离到溶液中，这将导致干涉光谱曲线向左移动。以干涉光谱曲线的偏移距/离(以 nm 为单位)与反应发生时间绘制的关系图被称为传感图(Sensorgram)。通过传感图，可在各种结合模型的基础上拟合出 ka， kd 和KD(Figure 3)的数值。 A D Figure 2： Principles of BLI. Figure3： Conversion of the BLl interferometric profile signal to sensorgrams. BLI动力学实验流程 Figure 4 展示了在 Octet@仪器上测定结合动力学的标准流程。Octet@的生物传感器提供多种化学界面，无需修饰即可快速轻松地固定配体。动力学传感器均可再生和重复使用，以进一步降低生物传感器的消耗和使用成本。在多通道、高通量Octet@系统中，可以同时平行检测多对结合反应，缩短实验运行时间，例如文库筛选，表位分类，实验条件优化，浓度梯度依赖性结合分析等。 Figure 4： A typical kinetics binding assay workflow using BLI. BLI 技术可用于定量分子的浓度，例如 lgG、Fc-融合蛋白、人 Fab、含 HIS标签或 GST-融合重组蛋白。应用Octet@或 OctetNI(BLItz)系统，生物传感器可在几分钟内确定纯化后或粗制样品中特定分析物的浓度。由分析物与生物传感器结合产生的结合曲线，其结合速率与分析物浓度是有相关性的(Figure5)。目前 Octet@有针对检测 Protein A、HCP残留、唾液酸含量以及甘露糖含量的商业试剂盒。用户也可以在 Octet@系统上轻松开发自己所需的高灵敏度定量分析方法。 Figure 5； Typical BLI quantitation assay dataset.Binding rates of the standards were calculated from the raw binding curves (A) andplotted against the knownstandard curve (B) to derive the protein concentration in the samples. SARTORIUS BLI 技术应用展示 3.1信号转导研究3.2结构功能研究 3.16天然产物/中药的研究 3.17 肿瘤靶向ADC药物研究 3.3致病机理研究 3.18 G 蛋白活性调控研究 3.4结构功能研究 3.19 低氧应答研究 3.5酶切活性研究 3.20 细菌感染机制研究 3.6蛋白复合物研究 3.21抗病毒活性分析 3.7致病机理研究 3.22耐药性研究 3.8膜蛋白研究 3.23 流感病毒研究 3.9垂钓未知分子 3.10 垂钓中药有效成分 3.11 DNA- 蛋白相互作用研究 3.12 RNA- 蛋白相互作用研究 3.13核酸适配体(Aptamer)研究 3.24 埃博拉病毒研究3.25细菌与抗体互作3.26细胞与分子互作3.27定量检测方法3.28纳米材料 3.14 小分子化合物筛选 3.29 表面化学研究 3.15 先导化合物的验证和表征 SD/LS OCTETR8 欲了解更多产品信息 【点击此处】或扫描右侧二维码 关注赛多利斯实验室 3.1信号转导研究 蛋白与蛋白Nature 磷酸化和线性泛素决定了 A20 蛋白的炎症抑制作用 ngridE. Wertz，Genetech 公司，肿瘤研究中心 关键词：炎症疾病， A2O 蛋白，泛素， TNF 信号通路 自身免疫性综合征和炎症疾病与编码A20 蛋白的TNFAIP3 基因的失活密切相关。作为一种泛素连接酶， A20 蛋白 ZnF 基序结合泛素并促进底物泛素化的功能是目前研究的热点。作者选择了ZnF中三个代表性的结构域来研究： a.几乎不与泛素结合的ZnF1； b.确定与K63-泛素三聚体结合的ZnF4，并将其进行结构稳定性突变(C624A， C627A)和泛素结合突变(Y614A， Y615A)；c.NMR数据显示可以结合结性泛素三聚体的ZnF7及其突变蛋白(F770A， G771A)。 作者将生物素化的ZnF1、ZnF4及其突变体、ZnF7及其突变体连接到SA传感器上，分别与K63连接的泛素三聚体、线性泛素三聚体及K48连接的泛素三聚体结合。 结果如上图平衡结合曲线所示：A20蛋白中的ZnF4区域主要与K63连接的泛素三聚体反应，而ZnF7区域主要与线性泛素三聚体反应，无论ZnF1、ZnF4、ZnF7均不与K48连接的泛素三聚体反应。具体亲和力常数(KD)见下表： Ub， (uM) Ub(uM) Ub，(uM) A20 ZnF A20 residues KD (uM) human murine mono-Ub tri-Ub K63 tri-Ub linear tri-Ub K48 ZnF4 WT WT 230±20 1.7±0.1 >50 N/D ZnF4 C624A. C627A C609A.C612A N/D N/D N/D N/D ZnF4 site l1629R 90±30 ZnF4 site llY614A， F615A Y599A， F600A N/D N/D N/D N/D ZnF4 site III K606E 110±30 ZnF4 site l+III I629R， K606E 50±13 ZnF7 WT 110±40 N/D 0.004±0.002* N/D ZnF7 F770A， G771A N/D N/D N/D N/D ZnF1 WT N/D N/D N/D N/D N/D： no detected binding *Value is for Ko strong； Ko weak=0.5±0.1pM 这说明结构的稳定性是ZnF与泛素三聚体结合的前提条件，任何影响结构稳定性及结合稳定性的改变均使其失去泛素连接酶的活性。同时ZnF4与ZnF7与泛素三聚体的结合不同，因此在一定条件下共同调节A20蛋白的功能。BLI技术非常直接地证明了A20蛋白在泛素连接酶的功能中起着决定性的地位。 参考文献(点击下方文献阅读原文) 信号转导研究(蛋白-多肽) 蛋白与多肽Science RALF4 /19 肽与 LRX 蛋白粗提物的相互作用以控制拟南芥中的花粉管生长 M.A. Mecchia， 苏黎世大学，苏黎世-巴塞尔植物科学中心 关键词：拟南芥， RALF4/19 多肽， LRX 蛋白，细胞生长 细胞外基质变化与细胞内部的交流对于细胞的功能至关重要。RALF家族的胞外肽被认为是 CrRLK1L亚类的受体样激酶的配体，但其确切的机制尚不清楚。本文研究发现拟南芥 RALF4 和 RALF19 可以调节花粉管的完整性和生长情况，其功能依赖于花粉中的 LRX家族蛋白。LRX 蛋白与 RALF 相互作用，并监测细胞壁的生长变化，通过 CrRLK1L 途径传递到花粉管内部维持正常生长。 如上图所示，作者首先将 GFP 抗体加入到融合 GFP的 LRX8的粗提物形成抗体受体复合物，然后用 proA 传感器固化抗体受体复合物，与不同浓度多肽进行相互作用。 BLI检测 LRX8 与 RALF多肽的原始数据 实时动力学曲线见上图，通过软件分析得到KD=0.9uM。说明LRX8与 RALF多肽直接结合。本文采用 proA传感器抓取 GFP抗体与 GFP融合蛋白的复合物来实现检测，说明BLI技术可以直接固化粗样品检测多肽，并且可以获得良好的重复性。 3.2结构功能研究 艰难梭菌毒素B靶向结肠上皮细胞的 Frizzled 蛋白 Min Dong， 加州大学，生理学与生物物理学系 艰难梭菌(Clostridium difficile，C. diff)感染是发达国家中抗生素相关性腹泻最常见的病因。其主要毒力因子艰难梭菌毒素B(TcdB)通过与 Wnt 受体的 FZD 蛋白家族的结合而靶向在结肠上皮。文章作者找到了与人 FZD2的半胱氨酸富集域(CRD2)结合的TcdB片段(1285~1804残基)，即TcdB-FBD。作者通过 BLI技术，将Fc-CRD2结合在AHC传感器上，与不同浓度的全长TcdB以及TcdB-FBD的不同突变体检测发现，蛋白质-蛋白质相互作用界面相关的突变(D1501A、Y1509A/N1511A和Y1509A/Q1599A)大大削弱了TCDB-FBD-CRD2的结合。野生型的亲和力是这些突变的43到138倍。 CRD2 文章利用BLI技术将Fc-CRD2固定于AHC传感器 上，进行多分子体系的结合实验，深入研究了TcdB-FBD-CRD2-Wnt复合物的功能机制。如右图所示：左：Wnt3A存在(红线)，Wnt3A不存在(蓝线，设 BSA 为对照)。 TcdB-FBD均可跟FZD2明确地结合。 右：Wnt3A和 TcdB-FBD 互换顺序后， TcdB-FBD存在(红线)时， Wnt3A 几乎不能结合。TcdB-FBD 不存在(蓝线，设 BSA为 综合上述结果及其他实验，文章揭示了内源性的 FZD结合的脂肪酸是 TcdB结合的共受体。TcdB结合 FZDs后会将脂质锁定在适当的位置，从而阻断Wnt信号通路。通过该研究，最终作者确立了脂肪酸在 FZD介导的 TcdB发病机制中的中心作用，并提出利用 TcdB 对 FZD的拮抗机制将毒素作为靶点用于治疗应用的潜在可能性。Octet@不仅可以用于点突变亲和力的检测，而且可以检测多个蛋白相互作用的关系。 参考文献，(点击下方文献阅读原文) 3.3致病机理研究 蛋白与蛋白Nature 艰难梭菌毒素B靶向结肠上皮细胞的 Frizzled 蛋白 Liang Tao， Min Dong， 波士顿儿童医院 &哈佛医学院，泌尿外科&微生物学和免疫生物学系关键词：艰难梭菌，毒素 B， Wnt 受体， Frizzled 蛋白 艰难梭菌(Clostridium difficile， C.diff)是"远近闻名"的紧急耐药胃肠道感染威胁，是抗生素相关腹泻和胃肠炎死亡最常见的病因。它对多种抗生素不敏感，而且服用抗生素会打破肠内菌群的平衡，导致艰难梭菌累积并产生大量的细胞毒素B(TcdB)，破坏肠内细胞。 本文利用 CRISPR/Cas9技术发现，敲除了FZD1/2/7基因的细胞对 TcdB具有很强的耐受性，敲除了FZD7的小鼠也可以抵抗TcdB的破坏。从而鉴定出 Frizzled 家族为 TcdB 的结合靶点。为了进一步在分子水平验证两者的结合，作者将 Fc-FZD 固定在AHC传感器上与 TcdB 毒素进行结合动力学分析，如下图所示： Fc-FZD TcdB 结果显示， TcdB与FZD1/2/5/7受体的 CRD 结构域均明显结合，其中FZD1/2/7结合较强(32nM/19nM/21nM)，而FZD5的结合相对偏弱(670nM)。说明部分 Frizzled 家族蛋白成员可能是做为 TcdB 的低亲和力受体。 参考文献((点击下方文献阅读原文) 核骨架和细胞骨架(LINC)复合物的连接体由SUN 和KASH结构域组成，并桥接核膜的内膜和外膜。LINC 复合物在细胞核定位，细胞极化和细胞僵硬中起关键的作用。本文作者研究确定了人类的 SUN-KASH 复合物的晶体结构，并对其复杂的结构进行了深入分析，发现SUN 结构域同源三聚体结合三个独立的"钩"样KASH 多肽。 0.6- ng)； 0.4- SUN (WT) cSUN (delAA)ooa SUN (G609D) 0.2- SUN (Y703E) SUN (A603E/ S641E/Y703E) 0.0- 50 100150200250300350400 Time，s Analyte Kd (nM) SUN (WT) 45.6 SUN (del AA') ND SUN (G609D) ND SUN (Y703E) 341 SUN (A603E/S641E/Y703E) ND ND： not determined Time， s 为了研究不同氨基酸位点在复合物形成中的作用，作者使用BLI技术，通过 SA传感器固定生物素化的 KASH和不同的SUN(野生型和突变体)进行结合实验。结果如上图所示，野生型的SUN与KASH具有最强的结合。除去AA'loop的SUN突变体不再结合KASH。而对SUN结合位点区域疏水口袋的保守氨基酸位点进行突变分析发现， G609D 单点以及A603E/S641E/Y703E三点突变后均极大地破坏SUN-KASH的结合。而Y703E 单点突变则未未明显影响结合信号。说明G609D/A603E/S641E 这些位点和 AA' loop 对于两个 另外，作者发现 SUN 结构域连接的两个基序(CC1和CC2)对 SUN-KASH 复合物的结合具有调控功能。CC1 直接结合核内膜，通过 CC2再与 SUN结构域结合。利用 BLI技术检测如右上图所示， SUN 可以直接与 KASH 结合， CC2-SUN则极大减弱了该结合，而 CC1-CC2-SUN 则是加强了这种结合。说明 CC1基序具有激活作用，而 CC2则是起到抑制作用。 3.5酶切活性研究 胰蛋白酶切割位点突变的 Exendin 4-Cysteine1 蛋白与蛋白Int.J.Mol.Sci 一一种口服生物利用的胰高血糖素样肽-1受体激动剂的系统设计 Wenbo Sai， 高向东，姚文兵，中国药科大学，生命科学与技术学院，江苏省药物分子设计与成药性优化重点实验室 关键词： Exendin 4， Cysteine1， 口服， TSME-1，II型糖尿病 Exendin-4 是治疗代谢综合征的强效治疗候选物，其相关的受体激动剂药物自2005年就开始上市销售。但是，技术缺陷和皮下注射引起的疼痛严重影响了患者的体验。 作者发现C57BL/6J小鼠口服 Exendin4-Cysteine 具有明显的降血糖作用。文章通过筛选得到了胰蛋白酶切割位点突变的Exendin4-Cysteine1(TSME-1)，几乎完全抗胰蛋白酶，还可以明显地将血糖水平正常化，并且 TSME-1的可用性显著高于Exendin-4 和 Exendin4-Cysteine。因此，口服型 TSME-1是未来治疗Ⅱ型糖尿病的强有力候选者。 在本研究中BLI技术起到了决定性的作用。如左图所示，作者将Exendin-4 固定在 SA 传感器上，然后与小肠分泌的不同蛋白酶(Trypsin/Chymotrypsin/Elastinase/CPA/CPB)进行结合实验，发现 Trypsin的酶切效率最高。这与 HPLC的筛选结果完全一致。然后作者选择Trypsin 作为主要的酶进行分析，并确定了特异性的酶切位点，并以此进行突变进行后续试验。 ( Wenbo， S a i. e t al. Systematic Design o f Trypsin Cleavage Site M utated Exe n din4-Cysteine 1， an Orally Bioavailable Glucagon-Like Peptide-1ReceptorAgonist. In t .J. Mol. Sci.， 1 8， 578 (2017) ) 蛋白与蛋白Cell 蛋白辅助分子伴侣招募 BiP 到单体化 IRE1并抑制未折叠蛋白质反应/ Niko， Wetzel， 剑桥大学，剑桥医学研究所 关键词：内质网应激(ER)，未折叠蛋白反应(UPR)， IRE1， Complex 当未折叠蛋白质在内质网(ER)中积累时，未折叠蛋白质反应(UPR)可以增强ER-蛋白质折叠能力以恢复蛋白质折叠稳态。未折叠蛋白质通过促进 IRE1(一种保守的跨膜受体)的寡聚化作用将穿过 ER膜的UPR信号激活至细胞。 本文研究表明， ER 辅助分子伴侣 ERdj4 能够与 IRE1结合并通过 ATP 水解的刺激招募 BiP形成复合物，并强行破坏 IRE1二聚体，抑制IRE1的二聚进而抑制UPR 的激活。这个复合物通过核核酸交换而解离， ERdj4 和 BiP 会重新招募单体或二聚的IER1，再次开始抑制 UPR激活的循盾。作者利用 BLI技术展示了整个复合物的形成过程，如上图所示， IRE1固定在SA传感器上，先结合不同浓度的 ERdj4，在 Buffer中不解离，结合很牢固。当转移到 BIP+ATP的环境中时，先出现明显的结合信号，然后很快发生解离。说明 BiP 将 ERdj4竞争下来，与IRE1结合并促使其解聚成单体。 ERdj4与IRE1的结合，然后与含有 ATP的野生型的 Bip结合，并促使IRE解聚 此外，作者将IRE1， ERdj4 和 BiP的突变体以及+/-ATP有无的情况做了多组对照，从而验证以上复合物的特异性反应过程，即IRE1-ERdj4-BiP+ATP。 Analyte： ERdj4 在IER1/ERdj4 复合物形成后，无法与不含有 ATP的或者突变的 Bip结合(招募)，只与含有 ATP的野生型的 Bip 结合，并促使IRE解聚 整个文章大量采用 BLI 技术，动态分析蛋白复合物形成过程，描绘了未折叠蛋白反应的信号调控机制。 参考文献(点击下方文献阅读原文) 3.7致病机理研究 蛋白与蛋白Nature Shigella 效应器泛素化和降解 GBP 以抑制宿主防御 李鹏，邵峰，北京生命科学研究所(NIBS) 关键词：志贺氏痢疾杆菌， GBP (鸟苷酸结合蛋白)，宿主防御 干扰素诱导的鸟苷酸结合蛋白(GBP)能够介导细胞自身的抗菌防御。志贺氏杆菌中编码一种分泌型系统效应蛋白侵入质粒抗原Hs(IpaHs)。IpaH 代表着细菌泛素连接酶的一个大家族，它们的功能还不清楚。 作者利用转座子筛选鉴定了志贺氏菌IpaH9.8的突变可以防止hGBP1的降解。通过 BLI技术，将 lpaH9.8固定在 SA 传感器上，与不同浓度的hGBP1进行动力学检测，发现两个蛋白具有明显的结合(如左图所示)。以此证明了 hGBP1为IpaH9.8 的受体。 当IpaH9.8不存在或者在 hGBP 与 IpaH9.8 的结合被干扰时，hGBP1转位到志贺氏菌的胞内，可以抑制细菌复制。为了验证这种突变的影响，作者将 hGBP1 固定在 SA 传感器上，与野生型和突变体的IpaH9.8进行结合，发现突变体完全不能结合hGBP1(如左图所示)。同时动物实验表明，当被 IpaH9.8 基因缺失的志贺氏菌感染后，小鼠可以存活，而野生型志贺氏菌感染后的小鼠则死亡。结果完全一致。 最终文章揭示了志贺氏痢疾杆菌效应蛋白lpaH9.8通过泛素化降解宿主细胞内被干扰素调节的 GBPs，从而抑制宿主的免疫反应并促进病原菌在宿主内的生存和增殖。IpaH9.8的活性充分说明了 GBPs在抗菌防御中的重要作用。 参考文献(点击下方文献阅读原文) 蛋白与蛋白Nature 构象生物传感器揭示来自内体的 GPCR 信号传导 RoshanakIrannejad， Mark von Zastrow， 加州大学，细胞与分子药理学系 关键词：生物传感器， GPCR， 信号传导 Recruitment phase 2 Biotin-B2-AR-rHDL NB80 一般认为G 蛋白偶联受体(GPCR)与异源三聚G 蛋白偶联介导的典型信号转导仅限于质膜。后来有人提出通过内化的 GPCRs 的信号传导受到G蛋白依赖机制的限制。例如 arrestins 的支架化，或者 GPCR 激活引发持续的G 蛋白的信号形式，或者内化的 GPCR 确实可以促进急性G蛋白介导的反应。但是支持这些假设的证据都是间接的或只是替代性解释，并且内体 GPCR的活性形式是否存在还不清楚。 本研究使用构象特异性抗体(纳米抗体)Nb80直接检测哺乳动物活细胞中的原型GPCR--B2-adrenoceptor(B2-AR)及其同源G蛋白Gs的激活。结果显示，异丙肾上腺素能够促进受体和G蛋白在质膜中的活化，而且在早期内体膜中也是如此，内化的受体在激动剂作用后数分钟内就可以促成整体细胞环AMP反应。这些发现直接证明了典型 GPCR 信号同时存在于内体以及质膜，并且为探测体内动态构象变化提供了更多样的策略。 本研究中，作者利用BLI技术将整合B2-AR的脂质体固定在SA传感器上，与NB80直接结合。验证两者之间具有很强的结合(如左下图示：KD=2.9nM)。同时发现，异丙肾上腺素(ISO)存在时，可以大大提高B2-AR与Nb80的结合(如右下图示)。 参考文献.(点击下方文献阅读原文) 3.9垂钓未知分子 蛋白与未知 应用目的：利用Octet@平台对混合物样品中目标靶分子进行垂钓并回收操作。 实验思路 将洗脱的样品进行质谱分析 在Octet@上，一般用链霉亲和素(SA)传感器固化已知分子，如下图所示： 固化已知分子传感器洗脱物 实验步骤 平衡(1分钟)粗样品中抓取特异结合分子(3-5分钟)洗脱(10秒)，重复30个循环 空传感器洗脱物 有固化已知分子传感器的垂钓结合曲线(1组)无固化已知分子传感器的垂钓结合曲线(2组)2组信号比1组低，说明有特异性物质被钓出来 用Octet@可以实现全自动的垂钓检测，可以实时检测是否有特异性物质被钓取，然后用质谱或者电镜进行分析。 参考文献(点击下方文献阅读原文) Acta PharmaceuticaSinica B 利用BLI技术和HPLC-MS高通量筛选淀粉样蛋白-B结合的天然小分子 Anguo Wu，et al. 西南医科大学 关键词：BLI，高通量筛选，中药有效成分，淀粉样蛋白-β 可尔茨海默病(Alzheimer's disease， AD)是一种与年龄相关的神经退行性疾病，是一种不可逆转的、不可治愈的神经退行性疾病。AD与B-amyloid (AB)的纤维化密切相关，会引发神经炎症和神经元的死亡。在AD早期靶向抑制AB纤维的形成已成为目前AD治疗的有效策略。西南医科大学研究人员将生物层干涉技术与高分辨质谱作为钓钩，以AB作为诱饵来发掘中药开心散中AB的小分子抑制剂。 将AB结合在SA传感器上，然后将开心散提取液与传感器上的AB进行结合并解离，将收集到的解离液应用高分辨质谱进行分析并鉴定。在开心散中发现去氢土莫酸(DTA)、猪苓酸C(PPAC)和土莫酸(TA)三个化合物与AB有着最强的结合力。通过色谱分离制备出这三个化合物后，然后在AD的细胞和线虫模型上对这些化合物的抑制AB纤维形成的活性进行了评价。研究发现，这些化合物在体内外均有很好的抑制AB纤维形成的活性。 结果展示 A 将生物素化 AB 固化在 SA 传感器上，发现开心散可以与其结合(Octet@Red96e) 用户之声：“这篇文章开发了一种通过Octet@从天然药物尤其是中药复方中鉴定出抑制AB活性的快速、简洁、可靠的高通量筛选方法，这为从天然药物中发现先导药物提供了很好的参考。” 参考文献(点击下方文献阅读原文) Compd. RT (min) 解离液用质谱进行检定，发现 DTA (RBA 5.95%)、PPAC(RBA 6.23%)和TA(RBA 2.23%)三个化合物的相对含量比较多 用Octet验证纯化的 TA可以和AB结合，并且再解离液中用 MS 可以检测到 TA High-throughput screening for amyloid-Bbinding natural small-molecules based on the combinational use of biolayer interferometry and UHPLCLDAD-Q/TOF-MS/MS. Acta Pharmaceutica Sinica B. 3.11 DNA-蛋白相互作用研究 蛋白与核酸Blood 与白血病相关的基因组功能研究 李易真，上海交通大学医学院，血液研究所陈竺实验室 关键词：基因调控，白血病致病机理 AML1/ETO 融合蛋白对 t(8；21) 急性白血病的形成非常重要，它与野生型的AML形成复合物，结合在基因组上的相邻序列. 通过 CHIP-Seq 和生物信息学的手段发现，在 AML1/ETO与AML1复合物识别的 DNA 序列上，富集了一个长的DNA序列(5TGTGGTTT3)和一个短的 DNA 序列(5'-TGTGGT)，后者包含在了前者中。为了量化验证两个序列对 AML1/ETO 或者 AML1 的识别的特异性，用 BLI技术检测包含短序列的两个 DNA 片段(S1，S2)和两个长序列 DNA 片段(L1，L2)与AML1/ETO 或者AML1的亲和力。 可见，AML1/ETO 与 S1，S2 的亲和力远远高于 L1，L2；而AML1与 L1， L2的亲和力高于 S1， S2。说明前者特异的识别短序列，而后者特异识别长序列。这个结果与EMSA以及 CHIP-qPCR的结果一致，但是 BLI 技术能够更快得到更加定量化的结果。 DNA序列 (将DNA固化在链霉亲和素传感器上与蛋白相互作用) KD (M) AML1/ETO AML1 S1 2.37E-09 4.55E-06 S2 3.33E-10 6.70E-07 L1 1.32E-04 1.08E-06 L2 1.38E-07 2.57E-09 3.12RNA-蛋白相互作用研究 蛋白与核酸 剪切体蛋白结构功能研究 Cell Research 施一公，清华大学，医学院 关键词：RNA代谢，构效关系 Lsm1-7/Lsm 2-8对 8A，8U的亲和力结果 (将RNA 固化在链霉亲和素传感器上与蛋白质相互作用) J 本文解析了U6小核核糖核蛋白中Lsm 蛋白质七聚体复合物Lsm1-7的晶体结构。Lsm1-7通过识别3'端的 mRNA的 oligoA或者 oligo U 的结构，介导 mRNA 从5'端的降解。应用生物层干涉技术比较了 Lsm1-7 和另外一种U6小核核糖核蛋白Lsm2-8与mRNA末端的5'-AAAAAAAA-3'和5'-UUUUUUUU-3'的亲和力，从生化分析角度解析 Lsm1-7 的功能。 Lsm1-7 对 8A，8U 的亲和力都是 uM级别，但是对8U有一定选择性(KD=2uM，比 8A的6uM强三倍)。而 Lsm2-8对 8U的亲和力(nM级别)远远高于8A(uM级别)，说明 Lsm1-7 和Lsm2-8对8A的结合模式一致，而Lsm2-8对 8U的结合特异性更好。 突变体亲和力分析获知， Lsm2/3/4/6上的 Arg突变成Ala后，对8U的亲和力下降显著，但是这些突变并没有导致对8A亲和力的大幅度下降，这个可能就是因为Lsm1-7对8U的有一定选择性结合引起的。 参考文献((点击下方文献阅读原文) GTX1/4与适配子的亲和力为Kon(1/Ms)=6.43E+04Kdis(1/s)=1.14E-03Kd(M)=1.77E-08 Time(see) 0.8 GTX1/4 0.8 200 ng/mL 0.6 c 0.6· 0.4 0.4 一E三 信号放大后PTX浓度依赖信号 BLI技术适用于适配子与靶点的亲和力验证。用链霉亲和素传感器固化生物素化适配子，检测 GTX(膝沟藻毒素)的亲和力。而该适配子与其他类型的贝类毒素(STX，GTX2/3)不反应或者反应非常弱。 BLI技术还可以实现对毒素的浓度测定。用固化适配子的传感器，检测不同浓度的GTX1/4。左图可见，浓度与信号曲线在0.2ng-90ng/mL范围内呈现良好的线性关系。 BLI技术也可以用竞争法和信号放大的方式建立基于适配子的毒素高灵敏度检测方法。 先将海葵毒素 PTX固化在氨基偶联传感器(AR2G)上，然后将传感器与 HRP(辣根过氧化物酶)偶联的适配子和含有 PTX的样品的混合物孵育，然后用 HRP的底物 DAB 进行信号放大。如果 PTX的混入浓度越高，检测的信号越低。整个实验只要10分钟就可以完成。检测极限为 0.04pg/mL。 将PTX加入到不同贝类的提取物中进行检测，已知浓度为50，200，800pg/mL，然后将计算的浓度与已知浓度进行比较获得回收率，每个实验重复三次。回收率在 100.27%-108.24%之间，说明贝类海鲜的提取物基质对检测没有明显影响。变异系数在 2.27%-6.76%之间，说明该方法的重复性非常好。 参考文献(点击下方文献阅读原文) ( Gonyautoxin 1/4 aptamers wi t h high-af f inity and h i gh-specificity： From efficient selection to aptasensor a pplication. Shunxiang Gao， et a l . B iosens Bioelectron. 2016 May 15；79：938-44 ) ( Enzyme-linked， aptamer-based， c ompetitive biolayer interferometry biosensorfor palytoxin. Shunxiang Gao， e t a l . Volume 89， Part 2， 15 March 2017， Pages 952 ) 基于生物层干涉技术的小分子片段化合物筛选 小分子化合物 Charles A 等，罗氏，纳特利研发中心 J.Comput. Aided Mol. Des. 关键词：生物层干涉技术 BLI， 片段筛选，蛋白-蛋白相 互作用，药物发现， FBDD 基于生物传感器的片段化合物筛选是药物研发过程中一个非常具有价值的工具。这种方法优于许多其他的生化方法，因为初级苗头化合物可通过具体的结合图谱以及响应值有效地从非特异性或非理想的相互作用中区分开来，从而减少假阳性。来自罗氏公司的研究人员利用 BLI技术通过模型系统和充分验证的靶点进行了小分子的检测和片段化合物的筛选验证，获得的亲和力常数和结合效价与表面等离子共振技术(SPR)高度一致。 在该项研究中，研究人员重组表达纯化得到AVI-Tag生物素标记的蛋白或通过体外的方式标记生物素(biotin-LCLC-NHSS)，将其固化至 SSA 传感器上。通过缓冲液建立基线噪音信号，以基线噪音信号的3倍标准差为cut-off 值筛选苗头化合物。使用了包含6500种化合物的片段文库对设计 PPI的 BCL-2、JNK1、elF4E 进行了筛选，比较了这些靶标苗头化合物的比率。其中，elF4E同时包含 PPI位点和核酸结合位点，与高通量的时间分辨荧光分析筛选得到的结果也进行了对比。 结果显示，BLI技术通过双扣除的方式(参比传感器与零浓度的分析物)，可以精准快速的进行数据的处理与分析(Figure1)，也在初级苗头化合物的筛选以及以估(Figure 2，Figure 3)中具有非常好的应用价值，可帮助确认生化分析法得到的化合物，BLI技术可鉴定非典型的结合(Figure 3中 F-I随着化合物的浓度提高并不能达到饱和信号，信号大于阳性化合物信号3倍以上，对于片段化合物不可能的慢解离)和筛选生化分析法未筛选得到的化合物。 Figure 2 Figure3 参考文献、(点击下方文献阅读原文) 3.15先导化合物的验证和表征 小分子化合物J.Med.Chem 溴结构域蛋白 BAZ2A/2B 选择性抑制剂的开发 Chen P， Chaikuad A， Bamborough P， 牛津大学结构基因组学联盟， Nuffield 临床医学系 关键词：Bromodomains、抑制剂、 BAZ2A/2B、GSK2801 Bromodomains(BRDs)是一类能够特异性识别乙酰化赖氨酸残基的保守蛋白结构域，存在于染色质及与转录相关的蛋白中，在细胞内由乙酰化介导的蛋白-蛋白相互作用中发挥极为重要的作用，是多种疾病(包括癌症、炎症和自身免疫疾病)的表观遗传医学靶点。包含 BRDs的 BAZ2A和 BAZ2B 蛋白是核仁重塑复合体(NoRC)的中心支架蛋白，而 NoRC 在调节非编码 RNA 的表达和抑制异染色质的形成方面发挥了作用。 目前， BRDs已经成为重要的药物作用靶点，已有众多针对BRDs 蛋白为靶点的小分子抑制剂成功开发，但BAZ2特异性 在本篇文章中，研究人员通过其他技术筛选得到了先导化合物，通过对侧链的修饰得到了BAZ2的特异性抑制剂GSK2801，并且 GSK2801具有很好的特异性。通过生物层干涉技术进一步验证了GSK2801与 BAZ2B的结合，亲和力为60nM(下图a)，与ITC结果一致，但BLI技术可以实时监测分子间的相互作用的整个过程， GSK2801与BAZ2B的结合呈现快结合与快解离的结合模式IE(K 1.57±0.02X105M-1S-1；K6.95±0.058X10-3S-)。 BLI技术通过对候选物的亲和力以及解离动力学数据进行甄选，有效地避免了在研发后期因不理想的结合表征数据而导致的项目失败。 Figure1 参考文献(点击下方文献阅读原文) 小分子化合物J.Med.Chem 高通量筛选激活素受体拮抗剂 Jie Zhu， Rama K. Mishra， 美国西北大学，费恩伯格医学院与生殖科学中心 关键词：虚拟高通量筛选，激活素， NUCC-47， NUC-55， ZINC 数据库 激活素属于TGF-B超家族的一员，与多种疾病相关，包括癌症、早产、骨质疏松等。靶向激活素及其相关的信号通路中的蛋白有望作为治疗这些疾病的治疗手段。先前的研究显示阻断激活素的信号通路，可逆转多种疾病的发展，但目前并没有有效的激活素的拮抗剂具有足够高特异性用于临床上治疗激活素信号通路介导的疾病。研究人员通过激活素晶体结构筛选用于特异性破坏配体/受体相互作用和激活素信号传 导的小分子结合口袋。再通过计算机模拟 ZINC 数据库虚拟筛选了1800万的化合物，综合考虑最终筛选得到39种化合物。研究人员继续通过 FSHB 转录、HepG2细胞凋亡、抑制卵巢细胞体外增殖和卵巢切除小鼠中激活素刺激的 FSH 的拮抗功能分析，筛选得到两种先导化合物：NUCC-47和NUC-55，体内实验显示 NUC-C55 是最有效的化合物，导致卵巢切除小鼠FSH水平的剂量依赖性降低。 研究人员利用 BLI技术分析了 NUCC-555对激活素和其配体结合的影响，竞争结果显示NUCC-555可竞争激活素和其配体的结合，研究人员将激活素配体 ALK4-ECD-Fc固化至 ProA传感器上，计算 NUCC-555对激活素与ALK4-ECD-Fc竞争影响，如图(Figure1)所示随着 NUCC-555的浓度提高，由于 NUCC-555与 ALK4-ECD-Fc 竞争结合激活素导致激活素与ALK4-ECD-Fc结合信号降低。由此证明 NUCC-555是选择性的竞争抑制激活素和其配体的结合，而不抑制肌骨素与其配体的结合(Figure2)。 Figure1 参考文献(点击下方文献阅读原文) Figure 2 枸杞多糖是一类重要的免疫调节剂，但其分子机制尚不清楚。在本研究中，研究人员报道了从枸杞多糖中纯化的多糖LBPF4-OL与TLR4-MAPK信号通路密切相关。研究发现LBPF4-OL能显著诱导野生型小鼠(C3H/HEN)腹腔巨噬细胞中TNF-a和IL-1B的产生，而不能诱导TLR5缺陷小鼠(C3H/HEJ)。同时， LBPF4-OL 刺激的C3H/HEJ小鼠淋巴细胞的增值明显弱于 C3H/HEN 小鼠淋巴细胞。 枸杞多糖LBPF4-OL 在 TLR4-MAPK 信号通路中活性功能 的研究 军事医学科学院，毒物药物研究所 关键词：枸杞多糖， TLR4-MAPK 信号通路， LPS， 诱导剂 用生物层干涉技术分析LPS和LBPF4-OL的相互作用，TLR4融合表达FC标签后通过AHC传感器固化至生物传感器表面，结果显示TLR4的激活剂LPS可以与其直接结合，但LBPF4-OL并不能与 TLR4结合(Figure1)。 流式细胞术分析表明，LBPF4-OL可以显著上调腹腔巨噬细胞和Raw254.7细胞中TLR4/MD2的表达。进一步的实验结果表明LBPF4-OL增加 p38 MAPK的磷酸化且抑制JNK和ERK1/2的磷酸化。这些实验结果显示，枸杞多糖 LBPF4-OL是一种新的Toll样受体4/MD2-MAPK信号通路的激活剂和诱导剂。 参考文献(点击下方文献阅读原文) 3.17肿瘤靶向ADC药物研究 蛋白-蛋白Cell ReportsMedicine GPC2 抗体 药物复合物通过构象表位进行结合，有效抑制神经母细胞瘤和小细胞肺癌 Raman，et al. 加拿大病童医院研究所 关键词：GPC2，神经母细胞瘤，小细胞肺癌， ADC， 构象表位 硫酸乙酰肝素糖蛋白-2(Glypican-2， GPC2)是一种 mycn 调控的、差异表达的细胞表面癌蛋白，是神经母细胞瘤免疫治疗的靶点。在本研究中，我们基于 GPC2的免疫治疗属性，发现 GPC2 在小细胞肺癌(SCLCs)上也是一个高表达的 mycn 驱动的癌蛋白，在 SCLC 和神经母细胞瘤干细胞室中均显著富集表达。通过3.3A分辨率的D3-GPC2-Fab/GPC2 复合物的晶体结构，发现 GPC2 导向的抗体药物偶联物(ADC；D3-GPC2-PBD)将 GPC2 抗体(D3)与 dna 损伤的吡咯苯二氮二聚体(PBD)连接起来，结合 GPC2核心胞外结构域的肿瘤特异性构象依赖表位。这种 ADC 通过诱导 DNA损伤、凋亡和旁观者细胞死亡，诱导神经母细胞瘤和SCLC 肿瘤持久消退，特别是没有 ADC 诱导的体内毒性迹象。这为 GPC2 靶向ADC 的临床转移提供了临床前数据。 本文中用到了赛多利斯的生物分析部门的三个仪器，分别是Octet@非标记分子互作分析系统， iQue@高通量流式细胞仪和Incucyte@实时活细胞成像系统。 Octet@非标记分子互作分析系统-ADC与靶点亲和力测试通过解析D3-GPC2-Fab/GPC2复合物的3.3A°分辨率下晶体结构，鉴定出 GPC2上与D3的结合位点(F95，K106，R103，R397等)，对这些位点突变后，与野生型相比，D3亲和力下降， Octet@结果验证了结构解析的结果。 将GPC2固化在NTA传感器上，与不同浓度的GPC2突变体结合(OctetRed96) 参考文献(点击下方文献阅读原文) ( AGPC2antibody-drug conjugate is efficacious against neuroblastoma and small- c ell lung cancer via binding a conformational epitope.Raman et al.， 2021， Cell Reports Medicine 2，100344 ) Incucyte@实时活细胞成像系统-抗体内化 抗体偶联药物(ADC)的作用机制是向细胞内输入细胞毒性物质引起细胞毒性杀死肿瘤细胞，其特异性和细胞的摄取程度对ADC的有效性和安全性至关重要。而抗体内化往往在几个小时内完成， Incucyte@就可以在培养箱的环境中边培养边拍照实时跟踪肿瘤细胞抱变化。 左图显示， GPC2能够增强ADC的内化。右图显示，该ADC能在不同的神经胶质瘤和小细胞肺癌细胞系中实现内化。 IQue@高通量流式细胞仪-膜蛋白组学非特异检测 为了检测ADC是否与其他蛋白产生交叉反应，将含有6000个膜蛋白的克隆库转到 HEK293T 细胞上表达，通过IQue@流式细胞仪检测，发现ADC不与其他任何膜蛋白有交叉反应。IQue@可以5分钟检测一块96孔板，10分钟检测一块384孔板。6000个克隆仅需1天即可完成检测。 该ADC不与其他任何膜蛋白有交叉反应，只与GPC2结合 小分子化合物The EMBO Journal 新藤黄素衍生物抗肿瘤机制的研究 Wangxu， 上海交通大学，附属第九人民医院 EZH2(enhancer of zeste homolog 2， Zeste 基因增强子的同源物2)是一种重要的原癌基因，也是恶性肿瘤极具前景的药物治疗靶点。目前 EZH2的抑制剂可强烈抑制一些恶性肿瘤中突变后活性增强的 EZH2的功能，但最近的研究显示抗肿瘤需要完全抑制 EZH2的活性。研究人员报道了新藤黄酸(GNA)的衍生物可特异性共价的结合至 EZH2 的催化活性结构域SET的668的半胱氨酸上。随后通过 Hsp70羧基末端反应蛋 ( 关键词：热休克蛋白70羧基端相互作用蛋白，共价抑制剂，EZH2，肿瘤蛋白，泛素化 ) 白(CHIP)介导的泛素化降解 EZH2(Figure 1)。这类抑制剂可显著的抑制H2K27Me3(组蛋白3上第27位氨基酸的三甲基化)的活性，有效激活被 polycomb 蛋白复合物2(PRC2)沉默的肿瘤抑制基因。细胞学实验显示新的抑制剂可显著的抑制依赖于 EZH2肿瘤的生长，而 C668S突变的 EZH2肿瘤细胞则显示出耐药性。 在该项研究中，研究人员通过生物层干涉技术直接验证了GNA以及其衍生物与 EZH2的结合(Figure2)。在小分子研究中，几乎很难避免使用 DMSO 等有机溶剂，生物层干涉技术对 DMSO等有机溶剂极端不敏感，使得实验分析更加方便快捷。 Figure1 Figure 2 研究发现 Rnd C 末端被 ROCK1 和 PKC 磷酸化后与 14-3-3相互作用， Rnd3 需要C末端240位的 ser 磷酸化和241位的cys 法尼基化才能稳定结合到14-3-3上。14-3-3通过结合Rnd3诱导其从细胞膜到细胞质的迁移而抑制Rdn3的生物学功能，从分子层面上阐明了 Rnd 蛋白活性调控的机制。通过解析RndC-末端肽段与14-3-3晶体复合体的结构发现，14-3-3精确地通过疏水界面与三异戊二烯基团结合。 研究人员采用生物层干涉技术BLI在蛋白水平进一步验证含不同修饰的Rnd3C 末端短肽与14-3-3的结合动力学，精确定量比较不同修饰的Rnd3 修饰后与14-3-3蛋白的结合。并且鉴定出14-3-3结合需磷酸化残基和最少两个异戊二烯基，14-3-3的结合口袋也能容纳更长的三戊二烯基(F)和四戊二烯基(GG)(Figure1)，且BLI的结果与ITC的结果一致。以及磷酸化和四异戊二烯基(GG)的 Rap1A 短肽呈现约 24nM 的亲和力与14-3-3结合，磷酸化和非四异戊二烯基(GG)的Rap1A短肽则是微摩尔级的，空白对照则无结合。(KD=24nM for Rap1A+P+GG， >1uM for Rap1A+P-GG， Figure2) Rnd3 peptide Kp (nM) kon (M-s-1) koff(s-) x2 B2 -P-F NB N/A N/A N/A N/A +P-F 1300 N/A N/A N/A N/A +P+lpr 556 2.4×10° 1.3×10 0.02 0.99 +P+G 56.5 5.7×10° 3.2×10-2 0.16 0.99 +P+F 32.4 8.6×10 2.8×10- 0.16 0.99 +P+GG 23.2 8.9×105 2.1×10-2 0.08 0.99 The affinities of differently modified C-terminal Rnd3 peptides for 14-3-3were determined by biolayer interferometry. Data of a typical experiment(n≥3) along with statistics of the fit (x，R?) are listed. See Table S3 forRnd3 peptide sequence. P，phosphorylated on S240； Ipr， isoprenylated；G， geranylated； F， farnesylated； GG： geranylgeranylated；Kp， dissociationconstant； kon， association rate constant； koff， dissocation rate constant；NB， no binding； N/A， not applicable. Determined by steady-state analysis. Figure 2 蛋白与多肽Nature 通过无序结构蛋白实现低氧应答的高灵敏终止 Rebecca B. Berlow， 美国斯克利普斯研究所，综合结构与计算生物学系与 斯卡格斯化学生物学研究所 关键词：低氧应答，无序结构蛋白，构象改变 TAZ1 细胞对缺氧的反应对细胞的生存至关重要，它能使细胞从缺氧压力中恢复，并适应不同的或波动的氧气水平。转录因子HIF-1a 亚基与转录辅激活因子 TAZ1 结构域结合并启动低氧应答，而CITED2竞争性抑制二者的结合以终止应答。本研究通过结构分析发现，三者形成的瞬时三元复合体会促进 TAZ1构象改变并使 HIF-1a 解离，揭示了细胞快速应答低氧信号的结构基础。 HIF1a和CITED2，被称作固有无序蛋白(intrinsicallydisordered proteins ，IDPs)。它们本身都不会折叠成稳定的形式，一直以一种非结构化的形式存在，生物层干涉技术分析研究显示HIF1a和CITED2与TAZ1的激活结构域(一段多肽)。 如果采用传统的分析方法，只能得到是否有结合的定性结果，而在该项研究中， TAZ1与 GST 融合表达后通过anti-GST传感器将 GST-TAZ1固化至传感器表面，精确定量分析了 TAZ1 与 HIF1a 和 CITED2 亲和力大小。结果显示 HIF1a 和CITED2与TAZ1亲和力相等，荧光异向性(fluorescence anisotropy)结果与 BLI检测结果一致。 0.3 E=c0.2coa 0.1 0.0 Peptide Ka (Anisotropy) Ka (Octet) HIF-1 776-826 10±2 nM 10±2nM HIF-1α 796-826 1.9±0.1 uM N.D. CITED2 216-269 10±1nM 9±2nM CITED2 216-242 36±10 uM N.D. 1，200 Figure 1 参考文献(点击下方文献阅读原文) 根瘤菌感染豆科植物，在根部诱导固氮根瘤的形成。这种共生关系在农业生产上有重要意义。豆科植物在它们所碰到的数千种不相容的土壤细菌中是怎样识别这些有益的共生伙伴的呢?在这项研究中， Stougaard 团队发现豆科植物是根据入侵细菌细胞表面上的“胞外多糖”(Exopolysaccharides，EPS)来辨别细菌属性的。而负责识别的是一种"胞外多糖受体"(EPR3)，该受体能识别与其相容的胞外多糖，从而控制共生性感染(Figure.1)。 研究中发现了很多证据表明 EPR3受体可以有效识别EPS，但最直接的方法无疑是检测 EPR3与 EPS 之间的结合亲和力。经由 SEC 得到纯化的EPS，标记生物素后，固化到链霉亲和素生物传感器表面；分析物则是 EPR3胞外结构域(Figure.2)。分析得到两个分子间的结合亲和力为2.7uM(Figure.3)，用麦芽六糖设为对照，则与 EPR3之间没有特异性结合。 生物层干涉技术作为体外测定方法，显示EPR3胞外域可以通过直接结合识别单体EPS并有效区分麦芽六糖。生物素化的多糖可以快速方便的固化到链霉亲和素传感器表面。 Time (s) Figure 3 参考文献i(点击下方文献阅读原文) HIV-1包膜糖蛋白120(gp120)可识别细胞CD4 的CD4i区域。CD4i被视为是抑制HIV-1进入细胞的潜在目标。从海参中提取的岩藻糖化糖胺聚糖(Fucosylated Glycosaminoglycan，FG)是一种新型硫酸化多糖，其细胞毒性小，具有较强的抑制HIV-1病毒活性。作者通过生物层干涉技术详细研究了这种机制，分析了 FG抗 HIV-1 活性的分子动力学。利用竞争性抑制试验和抗HIV-1活性分析以及凝血活性，建立了FG 的结构和 Wu Lian， 赵金华，中国科学院昆明植物研究所，植物化学与西部植物资源持续利用国家重点实验室 关键词：岩藻糖化糖胺聚糖(FG)， HIV， CD4， 构效关系(SAR)，竞争关系 生物活性之间的关系。 结合实验显示FG 的衍生物 FG3 与 gp120分子之间存在特异性结合，而与 CD4 分子没有结合(Figure.1A)。通过多浓度的动力学测定表明 FG3 与 gp120 的结合作用非常强，亲和力达到4.27 nM(Figure.1B)。 在FG3与gp120结合的基础上，作者又建立了基于BLI技术的竞争性抑制试验。将不同浓度的肝素(Heparin)、硫酸葡聚糖(DexS)以及FG 混入一定浓度的 gp120/scd4 复合物中，然后与固化在 SA 传感器上的 FG3相互作用，来观察它们对FG3 和 gp120分子相互结合的影响(Figure.2)。实验结果表明，在 CD4存在下，抑制 gp120结合的效力谱是 FG>DexS>Heparin。 参考文献 ((点击下方文献阅读原文) Lian W， ZhaoJ，Anti-HIV-1 activity and structure-activity-re/ationship study of a fucosy/ated glycosaminoglycan from an echinoderm by targeting theconserved CD4 induced epitope. Biochim Biophys Acta. 2013 Oct； 1830(10)：4681-91 超级细菌多药耐药性研究 蛋白与脂质Esther Garcia-Fernandez 等，西班牙国家研究委员会(CSIC)国家生物支术中心Cell关键词：金黄色葡萄球菌，脂筏(lipid raft)， 微结构域 (FMM)， 葡萄球菌黄素(staphyloxanthin) 来自西班牙的研究团队发现，在超级细菌的细胞膜上存在着被称作脂筏(lipid raft)的微结构域 (FMM)。这些由脂质和蛋白组成的微结构域，负责组装多种和抗生素耐药性相关的蛋白，使得细菌对常见抗生素产生耐药性。 研究者以耐甲氧西林金金色葡萄球菌(MRSA)为主要研究对象。应用BLI技术，分析了 flotillin(脂筏蛋白)的一系列突变体和 staphyloxanthin(葡萄球菌黄素，一种FMM参与成分)脂质体间的相互作用。通过结合亲和力数据的比较，发现flotillin 蛋白会优先结合FMM(葡萄球菌黄素)成分脂类。 由于脂质分子具有较强疏水性的特性，文中研究者将纯化的脂质分子(staphyloxanthin)通过疏水作用直接固化在 APS传感器(Figure1)，再检测和蛋白分子的互作反应(Figure2)，取得良好的效果。 参考文献(点击下方文献阅读原文) 病毒研究Nature 流感病毒与受体的相互作用 Xiaoli Xiong 等，英国医学研究理事会国立医学研究院 关键词：流感病毒， H7N9， H5， 受体，唾液酸类似物，血凝素 流感病毒通过识别细胞表面的受体进行感染，禽类受体是a2，3-连接唾液酸，而人类受体是 a2，6-连接唾液酸。禽流感病毒能够感染人类，就是因为流感病毒表面蛋白发生了突变，从而可以与人类受体结合所致。 干涉技术是非常好的研究流感病毒与其受体亲和力的工具，而且可以直接将病毒作为分析物。作者按不同密度将受体多糖固化在SA 传感器上，然后与单一浓度(100pM)不同来源的流感病毒进行反应。以固化密度和信号作图，曲线上升的越快，则说明亲和力越高。比如X-31型流感病毒，其对人类受体的亲和力比禽类受体的要强(Figure1)。这种方法可以最真实的反应人体环境中病毒的结合能力。 英国的研究人员发现，细胞表面的受体密度与固化在Octet@链霉亲和素(SA)传感器上的受体密度非常接近。所以生物层 另一篇研究 H7N9 流感病毒的文章也使用了这个方法。从 Figure2可以发现， H5型病毒完全丧失了与禽受体的结合能力，仅保留了与人类受体结合能力；H7型病毒对两者的结合能力旗鼓相当；而H3型虽然与两者都可以结合，但明显与人类受体结合的能力更强。 Wild-type H5 (avian) X-31 (human) X-31 (avian) ( 1.Xiong， X .， StevenJ. Gamblin， et al. ( 2013). Receptorbinding by an h7n9 influenza virus from humans. Nature， 499(7459)， 496-499.2.Xiong，X.， et al. "Receptorbinding by a ferret-transmissible H5 avian influenza virus. "Nature 497.7449(2013)：392-6. ) 病毒研究Science 中和抗体抑制埃博拉病毒的机理研究 John Misasi 等，美国国立卫生研究院(NIH)、清华大学和 Geisel 医学院等 关键词：埃博拉病毒(Ebola)，中和抗体，结构，糖蛋白(GP)，NPC1 研究人员在埃博拉幸存者体内分离到一株单克隆抗体(mAb114)，能够有效保护感染了埃博拉的猕猴。对mAb114进一步进行结构和功能解析发现埃博拉病毒表面糖蛋白(GP)和人体内的内涵体和溶酶体上的 NPC1受体发生结合，随之介导侵入人体。因此需要检测酸性条件下抗体与GP的 结合能力，以及其阻断 GP与 NPC1结合的能力。Figure1是mAb114 的 Fab 片段分别在中性和酸性环境下与 GP 结合的数据，可见该抗体在中性和酸性条件下都可以牢固的与 GP结合，且亲和力非常接近。 mAb114 与 GP结合后，可进一步阻断其结合到NPC1上。应用AR2G传感器固化 GP， 并依次和抗体和 NPC1受体结合。如果NPC1的结合信号大大降低，则说明抗体可以阻断两者的相互作用。Figure2是NPC1的结合，右边显示的是竞争抗体的名称。当 mAb114与之竞争时， NPC1 的结合信号大幅降低，说明 mAb114 抗体可以有效阻断两者的结合反应，从而发挥中和功能。 Figure 2 参考文献.(点击下方文献阅读原文) 在大肠杆菌表达体系中，研究者发现二聚化的亮氨酸拉链(leucine zipper) 可以融合抗体的重链(Hc)和轻链(Lc)，加速Hc 和 Lc 在大肠杆菌体内和体外表达系统中结合形成Fab(Figure1)。 通过这种方法，研究者得到了两个活性非常好的Fab-LZA/LZB 和 Fab-Jun/Fos 重组抗体，可以特异性、高亲和力的结合到 E. coli O157 细胞表面。应用 Blitz 系统，可直接检测大肠杆菌和抗体间的结合亲和力。研究者将大肠杆菌固化在 APS 传感器表面，不同浓度的 Fab 作为分析物，测定到的亲和力分别为20.9和15.9 nM(Figure2)。 Figure1 参考文献(点击下方文献阅读原文) ( Ojima-Kato， T eruyo， et al."Zipbody'leucine zipper-fused Fab in E. coli in vitro and in vivo expression system s ."Protei n Engineering Design & SelectionPeds 29.4(2016)：149. ) 基于细胞的非标记互作分析 Biosensors andBioelectronics D. Verzijl 等， Genmab 公司荷兰研发中心 关键词： Cell-based， 胶原(collagen)， 动态质量再分配(Dynamic mass redistribution) 研究人员第一次成功的将活细胞固化在传感器上，并检测到细胞和其他分子间的相互作用。文中采用将胶原蛋白固化在AR2G 传感器上，然后再将A431鳞状细胞癌细胞固化在胶原蛋白上，固化完毕后，用显微镜观察传感器表面的固化情况(Figure1)。 用 BLI技术检测表达在细胞表面的 EGFR 受体与 EGF 的反应。结合信号随着浓度的增加而增加，有明显的剂量依赖效应(Figure 2)。通过分析获得的亲和力值为2.2nM 左右，与报道值一致。 文中还尝试了小分子化合物(dopamine)、拮抗剂竞争以及抗体药物筛选等多项实验，均获取了理想的结果。作者还对信号产生的原理进行了阐述，认为是由动态质量再分配(Dynamic mass redistribution)效应引起了光干涉信号的变化。 Figure 1固化A431细胞的传感器的显微镜观察结果 Figure2 A431细胞(EGFR高表达)与EGF的结合 参考文献，(点击下方文献阅读原文) 粗提物中小分子毒素浓度检测 National Center for AgriculturalUtilization Research Chris M. Maragos， 美国农业部国家农业应用研究中心 关键词：竞争法，玉米粗提液，呕吐毒素 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol， DON)是禾本科镰刀菌和黑穗病菌的次级代谢产物。在全球范围内，DON的残留可以发生在诸如小麦、大麦和玉米等各种谷物中。为了保护人类和动物的健康，许多国家都建立了 DON 在谷物中限量的法规。在美国，人类食用的粮食中， DON 残留量不得超过1 mg/kg(1ppm)。 本文基于生物层干涉技术(BLI)的竞争法建立了在粗样品中进行小分子毒素的浓度测定方法。 实验步骤： A. ▪将偶联了DON的BSA固化在APS传感器上 用酪蛋白封闭 ▪将传感器孵育在DON抗体与含有DON面粉粗提物的混合液中·用甘氨酸缓冲液再生传感器，将抗体从传感器上洗下来 BLI检测灵敏度可以达到0.1 mg/kg；使用再生后的传感器，在0.2-5 mg/kg 范围内，平均回收率可以达到101.4 %， RSD 为 13.2%。并且传感器可以再生使用多次。检测8个样品的时间在10分钟左右。 用BLI技术对脱氧雪烯醇检测示意图 本文证明BLI技术可以用于粗样品的精确检测，而且成本低，速度快。 DON标准曲线 参考文献((点击下方文献阅读原文) 3.28纳米材料 Nature 磁性纳米材料检测 Satoshi Okada， 麻省理工大学，生物工程学院 Nanotechnology 关键词：纳米颗粒，聚合与解聚，脑脊液 磁性钙离子响应纳米材料(MaCaReNas)是一种由脂质体包被的氧化铁颗粒，如果在钙离子和突触结合蛋白 C2结构域(C2AB)存在的脑脊液中，这种纳米粒子可以聚合。如果没有钙离子，即使有C2AB也不能聚合。功能磁共振(fMRI)可以用这种材料检测脑内钙离子流。 将 C2AB固化在 NTA传感器上，与含有钙离子和不含钙离子的脑脊液中的 MaCaReNas 分别进行聚合和解聚。 Magnetic core +Ca²21 C2AB -Ca2+ lul PCPS coating 该纳米材料聚合与解聚示意图 纳米颗粒在有无钙离子的环境中聚合 (association)和解聚(dissociation)图谱 可见，在钙离子环境中， MaCaReNas 结合一半的时间为4.9s， 在无钙离子环境中，MaCaReNas 解离-一半的时间为 4.1s，证实了这种纳米颗粒非常适合用于 fMRI检测。 本文证明了BLI技术不仅可以检测纳米颗粒，也可以检测诸如脑脊液等粗样品。 参考文献：(点击下方文献阅读原文) ChemicalScience 可调控的对蛋白有亲和力的分子印迹表面 刘震组，南京大学，化工学院 关键词：分子印迹，表面化学，有机溶剂耐受 分子印迹是制备具有类似抗体或酶专一性仿生识别材料的重要技术，在生物传感、亲和分离和疾病诊断等领域具有广阔的应用前景。经过多年在硼亲和材料领域中的深入研究，研究人员发展出硼亲和可控定向表面印迹法。该方法能够便捷高效地制备出糖蛋白、聚糖和单糖的分子印迹聚合物。 实验步骤： ▪将溶解在甲醇中的甲酰苯硼酸与 APS 传感器过夜孵育，完成APS传感器表面的硼酸化； 将一种蛋白(HRP)模板固化在传感器上； ·将可以实现自聚的多巴胺和氨基苯硼酸混合物沉积在传感器上，在传感器表面形成分子印迹层； ·去除蛋白模板。这样就可以形成了对蛋白模板有亲和性的化学表面 该方法的原理见下图，先将模板分子固定到硼酸功能化的基质上，然后利用生物相容性良好的功能单体在基质表面聚合，形成合适厚度的印迹层以及与模板分子空间匹配的印迹腔。通过生物层干涉技术验证了目标蛋白与印记表面的特异性结合并精确计算了结合的强弱。所得分子印迹聚合物已经在疾病诊断、癌细胞靶向识别和活体单细胞分析等重要应用领域中展现出优越的分子识别性能。 Scheme 1 Schematic diagram of boronate affinity-based controllableoriented surface imprinting of glycoproteins. 然后用 BLI检测具有这种化学表面的传感器和 HRP蛋白模板的亲和力 A 0.81 一·10pgmL .5 pg/mL 0.6 -2.5pg/mL 选择合适的 Octet@系统 Octet@ 系统家族可满足广泛的应用及工作流程需要，赛多利斯当地的销售人员可为您提供 Octet@详尽的信息，配合我们丰富的 Octet@应用方案数据库，选出适合您需要的系统。 Octet@R2 系统2通道，科研型小分子和大分子表征 OctetR4 系统4通道，自动化小分子和大分子表征 Octet@R8 系统8通道，自动化小分子和大分子表征 OctetRH16 系统16通道， 高通量小分子和大分子表征 Octet@RH96 系统96通道，超高通量小分子和大分子表征 应用小分子应用大分子-例如病毒、VPL、田纳米颗粒、细胞DNA、RNA、多肽、蛋白分析物田E测量弱结合亲和力田品E测量强结合亲和力田E筛选应用-例如表位分选、田田一解离速率排序抗体表征定量测定(替代ELISA)抗体效价测定分析能力和工作流程效率通量 评级 低 高 Octet@R2 OctetR4 Octet@R8 OctetRH16 OctetRH96 系统 系统 系统 系统 系统 性能 最大同时读数 2 4 8 16 96 分子量检测限 150 Da 150 Da 150 Da 150 Da 150 Da 结合速率(k)范围(M1s) 101-107 101-10 101-10 101-107 101-10 解离速率(k.)范围(s)1 10--101 10--101 10-6-101 10--101 106-101 亲和力(K)范围 mM-pM mM-pM mM-pM mM-pM mM-pM 样品蒸发控制 否 否 是 否 否 最小样品体积 200 pL 200pL 200pL 40 pL* 40 pL* 数据采集频率(Hz) 2，5，10 2， 5，10 2，5，10 2， 5， 10 0.3，0.6，2，5，10 规格 光谱仪数量 2 4 8 16 16 温度控制 15-40°C 15-40°C 15-40°C 环境温度+4-40℃ 环境温度+4-40℃ 微孔板位置 1(96孔) 1(96孔) 1(96孔) 2(96或384孔) 2(96或384孔) 自动化整合 否 否 否 是 是 尺寸 尺寸高x宽x深(cm) 49x56x46 49x56x46 49x56x46 77×80×80 77×80×80 重量(kg) 32.7 32.7 32.7 68.2 90.7 *在384孔带有倾斜底部的微孔板中(Sartorius，货号18-5080) 生物传感器选择指南 5.1通用传感器 氨基丙基硅烷传感器(APS，Aminopropylsilane) 用途描述：利用蛋白或膜片段上的疏水基团吸附到传感器表面，适用于动力学筛选和亲和力表征分析 (kon， koff， KD)。 适用配体：蛋白，膜蛋白，脂类等 应 用：动力学(K) 货 号：18-5045 第二代氨基偶联传感器(AR2G，Amine Reactive 2nd Generation) 用途描述：蛋白样品可以以共价键的形式固定在传感器表面。通过 EDC/NHS 的酯化反应，使得蛋白上的氨基基团和传感器表面的羧基基团形成酰胺键。第二代氨基偶联传感器增加了结合密度，固化条件也更为稳定，同时大幅降低了非特异性结合。该传感器适用于蛋白和抗体的动力学筛选，亲和力表征分析(kon， koff， KD) 以及先导物验证。 适用配体：蛋白，抗体或多肽等含有氨基基团样品 应 用：动力学(K) 货 号：18-5092 链霉亲和素传感器(SA，Streptavidin) 用途描述：传感器表面包被有链霉亲和素，用以火联生物素标记的抗体、蛋白、多肽或核酸等样品。适用于配体结合分析、亲和力筛选、hit的验证，表位配对以及动力学表征 (kon， koff， KD) 等分析测定。 适用配体：生物素化的抗体、蛋白、多肽或核酸等 应 用：动力学(K) 货 号：18-5019 高精度链霉亲和素传感器(SAX， High Precision Streptavidin) 用途描述：传感器表面包被有链霉亲和素，经专门开发和生产，适用于对数据结果的精确性和重复性有着严格要求的药物研发和质量控制实验室使用。严格的 QC 检测确保产品间的 CV<4%(实际性能可能会有不同、需根据客户的实验条件而定)。 适用配体：生物素化的抗体、蛋白、多肽或核酸等 应 用：动力学(K) 货 号：18-5117 高精度链霉亲和素传感器 (SAX2.0， High Precision Streptavidin) 用途描述：固化生物素化分子，适用于高精度、高重复性动力学表征和浓度测定。 适用配体：生物素化的抗体、蛋白、多肽或核酸等 应 用：浓度测定(Q)，动力学(K) 货 号：18-5136 超级链霉亲和素传感器(SSA，Super Streptavidin) 用途描述：传感器表面包被有超高密度链霉亲和素，用以标记的抗体、蛋白、多肽或核酸样品。特别适用于小分子化合物结合分析实验和化合物片段筛选。 适用配体：生物素化的抗体、蛋白、多肽或核酸等 应 用：动力学(K) 货 号：18-5057 5.2抗体传感器 抗人 FC-捕获传感器(AHC，Anti-Human Fc Capture) 用途描述：利用特异性结合人源抗体Fc区域，将人IgG或其他人Fc融合蛋白固化于传感器之上。主要应用于动力学测定，包括蛋白和抗体的筛选、亲和力表征 (ka，kd，KD)，抗原表位配对以及 hit 的验证。 适用配体：人源IgG抗体 (IgG1， lgG2，IgG3，lgG4) 应 用：动力学(K) 货 号：18-5060 第二代抗人 FC-捕获传感器(Anti-Human Fc Capture 2nd Generation) 用途描述：利用特异性结合人源抗体 Fc 区域，将人 IgG 或其他人 Fc 融合蛋白固化于传感器之上。主要应用于动力学测定，包括蛋白和抗体的筛选、亲和力表征 (ka，kd，KD)，抗原表位配对以及 hit 的验证。具备比第一代更稳定的性能表现，可再生次数更多，定量的浓度范围更宽。 适用配体：人源IgG 抗体 (IgG1， lgG2， IgG3，lgG4) 应 用：动力学(K) 货 号：18-5142 抗人 FC-定量传感器(AHQ， Anti-Human IgG Quantitation) 用途描述：特异性结合人源抗体Fc区域或人Fc融合蛋白。主要用于在细胞培养、克隆选择、生产工艺优化以及产品质控等各个环节中，定量检测人lgG 浓度。 适用配体：人源IgG抗体 应 用：浓度测定(Q) 货 号：18-5001 抗鼠 FC-捕获传感器(AMC，Anti-Mouse Fc Capture) 用途描述：利用捕获的方法，特异性结合鼠源抗体的 Fc 区域。主要应用于抗体-抗原亲和力分亲 (ka，kd， KD) 以及基于解离速率的抗体筛选。 适用配体：鼠源 IgG 抗体 (IgG1， lgG2a， lgG2b， lgG3) 应 用：动力学(K) 货 号：18-5088 抗鼠FC-定量传感器(AMQ，Anti-Murine lgG Quantitation) 用途描述：特异性结合大鼠或小鼠 IgG 抗体的 Fv(ab')2 区域。主要用于在细胞培养、克隆选择、生产工艺优化以及产品质控等各个环节中，定量检测大鼠或小鼠 IgG 浓度。适用配体：鼠源IgG抗体应 用：浓度测定(Q)货 号：18-5022 第二代抗人 Fab 传感器 (FAB2G，Anti-Human Fab-CH12nd Generation) 用途描述：特异性结合人 IgG抗体的 CH1区域，适用于人源 Fab 和IgG 的定量检测和动力学表征分析。与自由轻链不存在结合。 适用配体：人源IgG抗体 应 用：浓度测定(Q)，动力学(K) 货 号：18-5125 Protein A传感器 (ProA， Protein A) 用途描述：ProteinA可高亲和力结合人 IgG 的Fc区域，与鼠或兔众多的lgG 亚型有较强结合。适用于细胞系开发、克隆筛选、过程优化以及产品监控等诸多应用中的 IgG 定量测定。 适用配体：IgG抗体(人、鼠、兔等) 应 用：浓度测定(Q) 货 号：18-5010 Protein G 传感器(ProG， Protein G)用途描述：Protein G 可高亲和力结合大小鼠、山羊或牛 IgG，与不同亚型的人 IgG 有较强结合。适用于细胞系开发、克隆筛选、过程优化以及产品监控等诸多应用中的 IgG 定量测定。适用配体：IgG抗体(人、大鼠、小鼠、山羊、牛等)应 用：浓度测定(Q)货 号：18-5082 Protein L 传感器(ProL， Protein L) 用途描述：Protein L 可高亲和力结合大部分大鼠、小鼠以及人的免疫球蛋白中的 kappa 轻链。不与山羊、牛、兔以及绵羊的IgG结合。适用于定量测定血清培养基中 IgG或 Fab 片段。适用配体：IgG 抗体或 Fab 片段(人、大鼠、小鼠等)应 用：浓度测定(Q)货 号：18-5085 5.3标签融合蛋白类传感器 抗 GST 传感器(GST，Anti-GST) 用途描述：通过高亲和力的抗 GST 抗体，既可以直接对 GST 融合蛋白进行快速定量；也可以稳定地捕获 GST融合蛋白用于动力学分析。 适用配体：含有GST标签的重组蛋白 应 用：浓度测定(Q)动力学(K) 货 号：18-5096 抗六价 HIS传感器(HIS1K，Anti-Penta-HIS) 用途描述：通过 Qiagen 公司的六价 His 抗体，特异性、高亲和力的捕获带有 His 标签的重组蛋白，适用于定量检测和动力学分析。 适用配体：含有HIS标签的重组蛋白 应 用：浓度测定(Q)动力学(K) 货 号：18-5120 抗 HIS传感器(HIS2，Anti-HIS) 用途描述：通过包被在传感器表面的抗 His 单克隆抗体，直接捕获和检测带有 His 标签的重组蛋白，适用于定量检测。 适用配体：含有 HIS标签的重组蛋白 应 用：浓度测定(Q) 货 号：18-5114 NTA传感器(NTA，Ni-NTA) 用途描述：带有 His标签的重组蛋白可通过镍离子介导，与传感器表面的NTA紧密结合，适用于定量检测和动力学分析。 适用配体：含有 HIS标签的重组蛋白 应 用：浓度测定(Q)动力学(K) 货 号：18-5101 5.4 Dip and ReadTM检测试剂盒 抗 CHO宿主细胞蛋白检测试剂盒(Anti-CHO HCP Detection Kit) 用途描述：Anti-CHOHCP检测试剂盒是由Octet@和Cygnus公司联合开发，用于定量检测产品中的 CHO细胞宿主细胞蛋白(HCP)残留。利用快速、高通量的Octet 分析平台，结合 Cygnus 3G anti-CHO HCP抗体的宽识别度和高灵敏度特性，使得 HCP检测两全其美。(更多信息，可在Octet@网站下载 Technical Note 41： CHO Host CellProtein Detection) 产品特点：全自动 HCP检测；一小时完成整个96孔板分析；检测灵敏度低至 0.5 ng/mL；检测精度高， CV范围5-10% 货 号：18-5081 蛋白A残留检测试剂盒 (Residual Protein A Detection Kit) 用途描述：Protein A 残留对于抗体药物生产质量是一个重要的指标。Protein A 残留检测试剂盒包含特制的生物传感器和所需试剂，用于检测抗体产品中 Protein A 或 MabSelect SuRe 等填料残留量。(更多信息，可在Octet@网站下载Technical Note 18： Dip and Read Residual Protein A Detection Kit) 产品特点：定量检测 Protein A或 MabSelect SuRe 残留；检测方法灵敏且精确；操作简便、易于使用；自动检测，手工操作大幅减少货 号：18-5075 GlyS 唾液酸化筛选检测试剂盒 (Sialic Acid Kit ) 用途描述：用于细胞上清液粗样品或纯样品中唾液酸的相对定量。(更多信息，可在Octet@网站下载 Technical Note ： Sialic Acid Kit User Guide) 产品特点：不需要将样品纯化或消化处理，可节省多达3个小时的样品准备时间；综合滴度结果与唾液酸化数据，尽早选择理想的表达株 货 号：18-5135 GlyM 甘露糖筛选检测试剂盒 (Manose Kit ) 用途描述：用于细胞上清液粗样品或纯样品中甘露糖的相对定量。(更多信息，可在Octet@网站下载 Technical Note ： Octet GlyM Kit For High-Throughput Mannose Glycans Screening of Crude and Purified mAb and Non-mAb Protein Samples) 产品特点：不需要将样品纯化或消化处理，在研发筛选的阶段即可综合滴度结果与甘露糖水平的数据，尽早选择理想的表达株。 货 号：18-5139 销售与服务联系方式 更多联系信息，请访问 www.sartorius.com.cn 赛多利斯(上海)贸易有限公司 邮箱lab.cn@sartorius.com 服务热线400 920 9889|800 820 9889 上海 上海市浦东新区盛荣路388 弄百佳通产业园3号楼， 7-11 层，200120 电话+8621 6066 6100 北京 北京市顺义区空港工业区B 区裕安路 33号， 101300 电话+8610 8042 6300 广州 广州市越秀区水荫路 117 号 1105单元， 510075 电话+8620 3761 7284 ( 技木规格如有变更，恕不另行通知。 ) ( 赛多利斯保留最终解释权和修改权。 ) ( 版本12|2021 ) 我欲了解更多产品信息【点击此处】或扫描右侧维码 中药的有效成分是其药理作用的基础，运用现代科学技术和手段研究、揭示中药的多成分、多分子效应机制，是当今中药学研究和发展的基本方向。通过研究中药有效成分与生物大分子之间的关系，有助于中药药理作用机制的研究和药物筛选，更有利于疾病的检测预防和靶向治疗。近年来，基于生物层干涉技术（Biolayer Interferometry，BLI）的Octet®非标记分子互作分析系统在中药调节信号通路传导、中药靶向治疗等方面的应用有了快速的发展[1]。➤ 中药有效成分靶点互作研究 [2]南京中医药大学通过亲和层析筛选与人参皂苷主要成分相互作用的蛋白，鉴定出14-3-3ζ蛋白为人参皂苷在脑组织中的潜在靶点。使用Octet®鉴定了20(S)- prototopanaxadiol (PPD，人参皂苷的代谢物)与14-3-3ζ 蛋白的直接相互作用（图1）。14-3-3ζ蛋白-PPD复合物的共晶体结构表明，14-3-3ζ蛋白的R56、R127和Y128氨基酸残基参与与PPD互作，其中任何一个残基突变都会导致PPD与14-3-3ζ蛋白的亲和力显著降低。该研究结果有助于更好地了解人参调节神经元活性的作用机制，为基于人参皂苷结构开发与14-3-3ζ结合的小分子化合物奠定基础。图1. 上半部分为中药新靶点发现与鉴定的技术路线：BLI（Octet®）主要用于鉴定靶点（14-3-3 ζ蛋白）与人参皂苷的结合；下半部分表格为靶点突变体与人参皂苷的亲和力测定。➤ 用靶点垂钓有效成分[3]西南医科大学BLI生物层干涉技术与高分辨质谱联合使用，并以Aβ作为诱饵来垂钓中药开心散（由远志、人参、茯苓和石菖蒲这4味中药组成）中可以与Aβ相互结合的潜在小分子抑制剂。1. 将Aβ结合在Octet®传感器上，然后将开心散提取液与传感器上的Aβ进行结合并解离；2. 将收集到的解离液应用高分辨质谱进行分析并鉴定，发现去氢土莫酸（DTA）、猪苓酸C（PPAC）和土莫酸（TA）三个化合物与Aβ有着最强的结合力；3. 通过色谱分离制备出这三个化合物后，然后在AD的细胞和线虫模型上对这些化合物的抑制Aβ纤维形成的活性进行了评价；4. 研究发现，这些化合物在体内外均有很好的抑制Aβ纤维形成的活性（图2）：图2. 纯化的TA与Aβ的亲和力检测➤ 天然产物构效关系研究[4]中国药科大学CDC37是一种新的肿瘤治疗靶点，天然产物雷公藤红素（celastrol）能够很好的抑制该靶点活性。现在从celastrol的基本结构（三萜）出发，合成了一系列化合物，用Octet®测定了所有化合物与药物靶点CDC37相互作用。1#化合物替换了A环的酮基，11#化合物改变了A环的羟基极性，BLI亲和力测试发现，1#的亲和力为90 μM，而11#化合物则无法与蛋白结合。说明A环的羟基极性对保持其活性是非常重要的（图3）。图3. 左边为Octet® Red 96测定的Celastrol衍生物与CDC37的亲和力，右边为根据BLI结果得出的化合物构效关系➤ 天然化合物库筛选和小分子竞争实验[5]澳门科技大学基于分子对接并结合Octet®互作仪在天然化合物中筛选潜在SARS-CoV-2抑制剂。一些天然化合物抑制SARS-CoV-2诱导的Vero E6细胞的病变效应和斑块形成，使其丧失明显的动物毒性并具有SARS-CoV-2假病毒突变体（D614G、N501Y、N439K和Y453F）的抗病毒效果。通过Octet®还发现，一些天然产物，比如EGCG、Bkc和Ibvc还与ACE2受体结合，体现与RBD和ACE2双重结合。Octet®还可以进行小分子之间的竞争实验，对小分子在蛋白靶点上的结合位点进行分组（图4）。与RBD结合的一系列天然化合物图4. Octet®小分子竞争实验:绿色为相互不竞争，红色为相互竞争BLI 技术在中药开发及研究领域的应用优势：节约样品：只需要μg级的蛋白量和μM级的小分子量；避免损失：没有复杂的流路系统，也没有泵和进样系统，减少样品的损失；经济高效：实验后还可将剩余样品进行回收，减少了前期纯化样品的工作量；快速便捷：耗时短，同时可以检测多种样品，实时监控检测结果，在前期中药筛选阶段，可以提高效率，节约宝贵时间。BLI 技术被广泛应用于中药研究中，成为中药分子机制研究的主流技术，为中医药走向世界提供有力的支持与保障。Download了解更多应用，请下载《生物层干涉技术应用文集》点击下载 获取全文-参考文献-《生物膜干涉技术在中药研究的应用》. 中国商品学会第五届全国中药商品学术大会Identification and confirmation of 14-3-3 ζ as a novel target of ginsenosides in brain tissues,Journal of Ginseng Research,2020,1226-8453High-throughput screening for amyloid-β binding natural small-molecules based on the combinational use of biolayer interferometry and UHPLCLDAD-Q/TOF-MS/MS. Acta Pharmaceutica Sinica B. 2021.Betulinic acid acetate, an antiproliferative natural product, suppresses client proteins of heat shock protein pathways through a CDC37-binding mechanism。RSC Adv., 2016, 6, 42537Identification of natural compounds as SARS-CoV-2 entry inhibitors by molecular docking-based virtual screening with bio-layer interferometry. Pharmacological Research 172 (2021) 105820