动物源性食品中瘦肉精检测方案(浓缩仪)

自动化样品前处理解决方案-RK-2020 Knowledge Optimized Laboratory 解决方案 动物源性食品中的4种瘦肉精类残留量的测定解决方案 全自动固相萃取；液相色谱-质谱/质谱；瘦肉精 “瘦肉精”属于B-激动剂类化合物，包括盐酸克仑特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇等十几种物质，是一类动物用药的统称，属于肾上腺类神经兴奋剂。任何能够促进瘦肉生长、抑制动物脂肪生长的物质都可以叫做“瘦肉精”，对于减少脂肪增加瘦肉作用非常好。 “瘦肉精”让猪的单位经济价值提升不少，但它有很危险的副作用，会引起心律不齐甚至是心脏脏。近年来(2011年)，因食用被“瘦肉精”污染的食物导致中毒事件屡有发生，且后果极其严重，引起了世界各国的高度重视。 为了保证畜产品质量安全，保护人类健康，许多国家都禁止在食源性动物的生产中使用盐酸克伦特罗，美国食品与药品监督管理局(FDA)将肉品中的盐酸克伦特罗残留作为必检项目，欧盟也严禁在饲料中添加“瘦肉精”类药物。我国虽然于2000年提出禁止使用“瘦肉精”类药物，但在畜牧业生产中“瘦肉精”的使用仍屡禁不止，如，在2011年河南省和江苏省发生济源双汇的“瘦肉精”事件以及2021年“3.15晚会”中曝光的沧州青县瘦肉精羊肉问题，都对社会造成了很大的反响。 依据《GB/T22286-2008动物源性食品中多种B-受体激动剂残留量的测定液相色谱串联质谱法》，试样中的B-激动剂经过酶解，用高氯酸调节PH值，沉淀蛋白后离心，上清液用氢氧化钠调节PH后用异丙醇-乙酸乙酯提取，用阳离子交换柱净化，采用液相色谱-串联质谱法进行测定，内标法定量。 1.介绍 “瘦肉精”属于β-激动剂类化合物，包括盐酸克仑特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇等十几种物质，是一类动物用药的统称，属于肾上腺类神经兴奋剂。任何能够促进瘦肉生长、抑制动物脂肪生长的物质都可以叫做“瘦肉精”，对于减少脂肪增加瘦肉作用非常好。 “瘦肉精”让猪的单位经济价值提升不少，但它有很危险的副作用，会引起心律不齐甚至是心脏病。近年来(2011年)，因食用被“瘦肉精”污染的食物导致中毒事件屡有发生，且后果极其严重，引起了世界各国的高度重视。 为了保证畜产品质量安全，保护人类健康，许多国家都禁止在食源性动物的生产中使用盐酸克伦特罗，美国食品与药品监督管理局(FDA)将肉品中的盐酸克伦特罗残留作为必检项目，欧盟也严禁在饲料中添加“瘦肉精”类药物。我国虽然于2000年提出禁止使用“瘦肉精”类药物，但在畜牧业生产中“瘦肉精”的使用仍屡禁不止，如，在2011年河南省和江苏省发生济源双汇的“瘦肉精”事件以及2021年“3.15晚会”中曝光的沧州青县瘦肉精羊肉问题，都对社会造成了很大的反响。 依据《GB/T 22286-2008动物源性食品中多种β-受动激动剂残留量的测定液相色谱串联质谱法》，试样中的β-激动剂经过酶解，用高氯酸调节pH值，沉淀蛋白后离心，上清液用氢氧化钠调节 pH 后用异丙醇-乙酸乙酯提取，用阳离子交换柱净化，采用液相色谱-串联质谱法进行测定，内标法定量。 图-1.盐酸克伦特罗的结构式 图-2.莱克多巴胺的结构式 图-3.硫酸沙丁胺醇的结构式 图-4.特布他林的结构式 关键字：：全自动固相萃取；液相色谱-质谱/质谱；瘦肉精 1.仪器和耗材 仪器 Raykol Fotector Plus 高通量全自动固相萃取 Agilent 1290II/6470 高效液相色谱-串联质仪 谱 Raykol EVA-60 全自动平行浓缩仪耗材 MCX 固相萃取柱 (RayCure， 60mg/3mL) 试剂 乙酸乙酯、异丙醇、甲醇均为色谱纯；甲酸、高氯酸、氨水、氢氧化钠；β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶。 0. 2mol/L 乙酸钠缓冲液：称取13.6g乙酸钠，溶解于500ml水中，用适量乙酸调节 pH至5.2。 标准品：莱克多巴胺盐酸盐，克伦克罗盐酸盐，沙丁胺醇，特布他林硫酸盐，100ng/ml。 内标物：沙丁胺醇-D3，克伦特罗-D9， 10ng/ml。 2.1酶解 准确称取5g(精确到0.01g)经捣碎的样品于50mL离心管内，加入0. 2moL/L 乙酸钠溶液(pH=5.2)20mL， 再加入β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶2.2提取 添加1ml 的内标工作液于待测样品中，加盖置于水平振荡器震荡15min， 5000r/min 高速离心10min， 准确取 10mL 上清液于另一50mL 离心管中，用高氯酸调节PH至1.0±0.3，4000r/min离心5min，将上清液转移至另一50mL离心管中，用10moL/L氢氧化钠溶液调节pH至11，加入4~5g氯化钠，加 2.3净化 将 MCX 固相萃取柱安装在Raykol FotectorPlus 高通量全自动固相萃取仪上，依次用甲醇3mL、水3 mL活化。备用液全部过柱，用水2mL、2%甲酸水 2ml、甲醇2mL依次淋洗，抽干，用5%氨水甲醇溶液2mL洗脱，收集洗脱液，使用 EVA-60plus 100pL，漩涡混匀，，于37℃下避光水浴水解 12h。 入异丙醇：：乙酸乙酯=6：4115mL，充分提取，4000r/min 离心5min，吸取全部有机相到睿科全自动氮吹浓缩仪 EVA-60plus 50℃下氮气吹干，加入0.2M乙酸铵溶液5mL 溶解，超声混匀，使残渣充分溶解后备用。 全自动氮吹浓缩仪于40℃水浴氮气吹干，用10%乙腈水溶液(含0.1%甲酸)1.0mL溶解，滤过，液相色谱-串联质谱测定。具体的固相萃取方法见图。 2.2固相萃取净化条件 全自动固相萃取仪 Raykol Fotector Plus 固相萃取柱 MCX 固相萃取柱 (RayCure，60mg/3mL) 活化 甲醇、水 淋洗 水、2%甲酸水溶液、甲醇 洗脱 5%氨水甲醇 廋肉精.m 序号 命令 溶剂 排出 速(mL/min) mi53 1 清洗样品通道 CH30H 2.8 2 活化 CH30H 有机废液 2 3 1.9 3 活化 H20 有机废液 2 3 1.9 4 上样 有机废液 1 6 6.6 5 清洗样品瓶 2%甲酸水 有机废液 80 5 5.9 6 淋洗 H20 有机废液 2 2 1.4 7 淋洗 2%甲酸水 有机废液 2 2 1.4 8 淋洗 CH30H 有机废液 2 2 1.4 9 吹干 5 10 洗脱 5%氨水甲醇 收集 0.5 2 4.5 11 气推 收集 1 2 2.4 12 气推 收集 80 20 1.6 13 结束 Fotector Plus 高通量全自动固相萃 Fotector Plus 固相萃取方法 取仪 3.液质检测条件 3.1液相条件 Column 色谱柱 Eclipse SB C18， 50mm ×2.1mm， 1.8u m Column oven 柱温 30°C Flow rate 流速 0.2 mL/min Injection volume 进样量 10pL 3.2液相梯度洗脱条件 时间/min 流动相A (0.1%甲酸溶液) 流动相B(乙腈) 0.0 95% 5% 2.0 95% 5% 4.0 50% 50% 8.0 70% 70% 10.0 50% 50% 15.0 90% 10% 3.3质谱仪器参数 离子源 电喷雾源 电离模式 多离子反应监测(正)模式 喷雾针压力 45 psi 喷雾加热区电压 干燥气(氮气)温度 1500V 325℃ 干燥气流速 5L/min 鞘气温度 350℃ 鞘气流速 10L/min 毛细管电压 4000V 增益电压 600V 3.4 MRM 参数 No.序号 Compound Name化合物名称 Precursor Ion 母离子 Product Ion 子离子 Dwell离子监测时间 Fragmentor 裂解电压 Collision Energy碰撞能量 1 克伦特罗 277 203* 30 90 15 259 30 90 5 2 莱克多巴胺 302 164* 30 90 10 284 30 90 5 3 沙丁胺醇 240 148* 30 100 15 222 30 100 5 4 特布他林 226 152* 30 90 5 125 30 90 10 5 沙丁胺醇-D 241 151* 30 100 15 6 克伦特罗-D， 286 204* 30 90 10 图54种瘦肉精类 MRM 色谱图 为了验证该方法的回收率，本实验分别在猪肉样品中加入盐酸克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、特布他林4种混合标准品进行加标回收验证(n=3)，加标水平为 0.5ug/kg，数据如表-2所示。加标回 收率在87.8-112.4%之间， RSD 值控制在10%以内。说明该方法能够很好地运用于猪肉中瘦肉精残留量的检测。 表-2.猪肉样品加标回收率及 RSD 值 序号 化合物 添加浓度ug/kg 回收率(%)样品-1 回收率(%)样品-2 回收率(%)样品-3 平均回收率(%) RSD(%) 1 克伦特罗 2.5 92.6 87.8 95.2 91.9 3.3 2 莱克多巴胺 2.5 102 98.0 101.5 100.5 1.8 3 沙丁胺醇 2.5 99.2 95.7 101.6 98.8 2.5 4 特布他林 2.5 111.1 111.0 112.4 110.7 1.6 注：其中克伦特罗的内标为克伦特罗-D9；沙丁胺醇、特布他林与莱克多巴胺的内标为沙丁胺醇-D3。 本解决方案操作方便、提取和浓缩效率高、回收率好。符合 GB/T 22286-2008《动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定液相色谱串联质谱法》要求。 EVA 系列全自动平行浓缩仪可以自动完成样品的浓缩，采用氮吹针追随的方式使得浓缩进程更 快，并节省氮气；Fotector Plus 高通量全自动固相萃取仪采用全自动操作，可以排除人员操作带来的误差，从活化到上样、洗脱一步到位，六通道同时进行；同时 Fotector Plus 能够实现高通量处理，最多一天能够处理180个样品，省时省力，真正为批量检测提供帮助。 Raykol 睿科集团股份有限公司 RayKol Group Corp.， Ltd. 网址： www.raykol.com 电话：400-885-1816 邮箱： info@raykol.com 本文中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知◎睿科集团股份有限公司 2020年10月版 邮箱： info@raykol.com热线：址：www.raykol.com “瘦肉精”属于β-激动剂类化合物，包括盐酸克仑特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇等十几种物质，是一类动物用药的统称，属于肾上腺类神经兴奋剂。任何能够促进瘦肉生长、抑制动物脂肪生长的物质都可以叫做“瘦肉精”，对于减少脂肪增加瘦肉作用非常好。“瘦肉精”让猪的单位经济价值提升不少，但它有很危险的副作用，会引起心律不齐甚至是心脏病。近年来（2011年），因食用被“瘦肉精”污染的食物导致中毒事件屡有发生，且后果极其严重，引起了世界各国的高度重视。