水产品中四环素类药物检测方案(液质联用仪)

SSL-CA22-059Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-623 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD. -Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cnTel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn LC-MS/MS 法分析水产品中四环素类药物残留 LCMSMS-623 摘要：本文利用岛津三重四极杆液质联用仪，建立了水产品中5种四环素类抗生素残留量的测定方法。样品经Na，EDTA-Mcllvaine 缓冲液提取，固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱法测定。结果显示该方法在5~200ng/mL浓度范围内建立标准曲线，线性相关系数均大于0.999，线性良好；精密度考察中各物质保留时间RSD分布在0.13%~0.21%之间，峰面积RSD分布在1.06%~2.82%之间；5种四环素类抗生素物质的检出限在0.03~0.37 ug/kg范围之间，定量限在 0.08~1.13 ug/kg 之间，表明仪器灵敏度良好，50 ug/kg加标回收率70.4%~105.1%之间。该方法分析速度快，灵敏度高，准确度好，适用于鱼虾等水产品中5种四环素类抗生素的含量测定，也可为相关从业人员分析检测提供参考。 关键词：三重四极杆液质联用仪 水产品 四环素类抗生素 四环素类抗生素((Tetracyclines， TCs) 为广谱抗生素，青霉素类抗生素因结构含有β内酰胺环，也称β内酰胺类抗生素。对革兰氏阳性和阴性细菌、立克次氏体等均有抑菌作用，其作用机理主要是和30S核糖体的末端结合，干扰细菌蛋白质的合成。常用的四环素类抗生素有：四环素、金霉素、土霉素、强力霉素、去甲基金霉素等。四环素类药物进入兽用领域已有多年，病原菌对四环素类已产生耐药性，且耐药性严重程度不容忽视。此类抗生素的不合理使用，为食品安全带来隐患。GB 31650-2019《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》中规定，在鱼虾中土霉素、四环素、金霉素最大残留限量 (MRLs) 200 ug/kg， 强力霉素 MRLs 100 ug/kg。 此前， GB/T 22961-2008《河豚鱼、鳗鱼中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定液相色谱- 实验部分 紫外检测法》规定了河豚鱼和鳗鱼中4种青霉素类化合物残留的测定方法。近期， 《GB 31656.11-2021食品安全国家标准水产品中土霉素、四环素、金霉素和多西环素残留量的测定》对 GB/T 22961-2008标准进行了更新，修改了标准适用范围，修改了方法的检测器，由紫外检测器改为荧光检测器；增加了增加液相色谱-串联质谱测定方法。 四环素类抗生素易光解，且易与金属离子反应生产不溶性络合物，在前处理和三重四极杆液相色谱质谱联用仪测定方面面临诸多挑战，本文参照《GB31656.11-2021食品安全国家标准水产品中土霉素、四环素、金霉素和多西环素残留量的测定》，增加了去甲基金霉素，解决了四环素类化合物系统残留问题，建立了水产品中5种四环素类抗生素残留的检测方法。该方法快速、准确、灵敏度高，可以用于水产品中四环素类抗生素药物的准确测定。 1.1仪器配置 岛津超高效液相色谱与三重四极杆质谱仪联用系统 LCMS-8045。具体配置为 输液泵：LC-20ADx×2 系统控制器：CBM-20A 自动进样器 ：SIL-30ACMP 三重四极杆质谱仪：LCMS-8045 柱温箱：CTO-20AC 色谱工作站：LabSolutions Ver. 5.97 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱柱： Shim-pack GISS[Metal free] (100 mm x 2.1 mml.D.，3um)， 岛津(上海)实验器材有限公司，P/N：227-30924-02 流动相：A相-0.1%甲酸水溶液；B相-乙腈 流速： 0.3mL/min 进样量：5uL 柱温：40℃ 洗针模式：RO->R3，均为0.1%甲酸水：甲醇：乙腈：异丙醇享(1：1：1：1) 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为20%，时间程序见表1。 样品瓶：PP材质样品瓶或采用惰性化处理的玻璃样品瓶 表1 梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 5.00 Pumps Pump B Conc. 35 5.60 Pumps Pump B Conc. 90 6.50 Pumps Pump B Conc. 90 6.60 Pumps Pump B Conc. 20 9.00 Controller Stop 质谱条件 质谱仪：LCMS-8045 脱溶剂管温度：250℃ 离子源： ESI+ 加热模块温度：400℃ 雾化气：氮气3L/min 接口温度：300℃ 干燥气：氮气10 L/min 扫描模式：MRM 加热气：空气10 L/min MRM 参数：见表2 表2 MRM 参数 序号 化合物 保留时间(min) 前体离子 (m/z) 产物离(m/z) cE (V) 465.00 154.10* -31.0 1 去甲金霉素 DMCTC 2.67 465.00 448.00 -18.0 479.20 444.10* -24.0 2 金霉素 CTC 3.52 479.20 154.10 -28.0 445.20 428.20* -16.0 3 强力霉素 DC 4.08 445.20 154.10 -34.0 4 四环素 TC 2.08 445.20 410.20* -22.0 445.20 427.00 -16.0 5 土霉素 OTC 1.77 461.20 426.00* -18.0 461.20 443.10 -14.0 *定量离子对 1.3样品前处理 准确称取样品2.0g， 置于50mL离心管中，准确加入 NazEDTA-Mcllvaine缓冲液6mL，醋酸铅溶液2mL，涡旋60s，分散均匀，超声提取 10 min， 再以8000 r/min 转速离心5 min， 吸取上清液于50 mL离心管中，加入5mL Na，EDTA-Mcllvaine缓冲液重复提取2次，合并三次上清，待用。上清液加正己烷10 mL，混匀，静置，取下层溶液，加入NaEDTA-Mcllvaine定容至20.0 mL，取10.0 mL过HLB小柱净化，甲醇-乙酸乙乙5mL洗脱，氮吹至近干，初始流动相定容至1.0mL，上机。 1.4标准溶液制备 基质标准系列工作液的配制：取空白样品，按照前处理净化，氮吹至近干，分别准确加入混合标准中间工作液适量，初始流动相定容至1.0 mL， 配制成浓度为5、10、20、50、100、200 ng/mL的标准工作曲线，待上机分析。 结果与讨论 2.1色谱柱筛选 已有研究表明，四环素类化合物分析时，流动相中添加三氟乙酸，可有效抑制二次保留，改善峰形，但三氟乙酸易在质谱系统统留，抑制负离子模式信号。为避免出现此不良情况，本试验采用了内壁涂层为 PEEK 材质的色谱柱， Shim-pack GISS+PEEK (100 mm x2.1 mm l.D.， 3 um)色谱柱进行分析，在甲酸做添加剂的条件下，获得了更加对称的峰形，色谱峰无拖尾，同时避免了柱上残留。5种四环素在 Shim-pack GISS (100 mmx2.1mm l.D.， 1.9 um) 和 Shim-pack GISS+PEEK (100 mm x 2.1 mm l.D.， 3 um)色谱柱上保留行为如图1所示，以土霉素 OTC 为例，同等条件下 GISS 色谱柱上拖尾因子为1.45， 而 GISS+PEEK 色谱柱上拖尾因子为1.05，色谱峰形良好，通道无干扰。因此，最终以 Shim-pack GISS+PEEK 作为色谱柱进行分析。 图15种四环素类抗生素标准溶液的 MRM 色谱图 2.2标准曲线线性范围 按照1.4方法配制标准系列溶液，上机分析得出各化合物的线性范围和线性关系，对比了普通玻璃样品瓶、pp材质样品瓶和惰性化处理玻璃样品瓶的吸附情况。结果表明，普通玻璃瓶配制的标准曲线，判定系数<0.99， 而 pp材质样品瓶和惰性化处理玻璃样品瓶线性良好，详见表3。5种四环素类抗生素在5~200 ng/mL范围内，线性良好，判定系数 R2 均>0.999，准确度95.4%~106.5%之间。5种四环素类抗生素标准曲线见图2。 表355种四环素类抗生素的线性关系 序号 化合物 线性方程 判定系数 R2 准确度 (%) 1 去甲金霉 DMCTC Y=(32669.2)X+(23923.6) 0.9996 95.6~106.5 2 金霉素 CTC Y=(10303.5)X+(5181.24) 0.9993 95.6~108.8 3 强力霉素 DC Y=(29940.6)X+(19922.0) 0.9995 95.4~104.8 4 四环素 TC Y=(39566.6)X+(26427.0) 0.9995 97.2~104.3 5 土霉素 OTC Y=(33009.4)X+(11861.2) 0.9996 96.3~104.2 图2 5种四环素类抗生素的校准曲线 2.3精密度考察 取10 ng/mL的基质标准溶液，注入液相色谱串联质谱仪，平行测定6次，计算保留时间(R.T.)和峰面积(Area)的RSD%。结果显示各物质的保留时间(R.T.)的RSD在0.13%~0.21%之间，峰面积(Area)的RSD在1.06%~2.82%之间，实验结果表明精密度满足实验需求。具体结果详见表4。 表4 精密度考察结果 (n=6) 序号 化合物 RSD% R.T. Area 去甲金霉 DMCTC 0.21 1.86 金霉素 CTC 0.13 2.72 强力霉素 DC 0.15 2.82 4 四环素TC 0.19 1.06 5 土霉素 OTC 0.15 1.32 2.4检出限和定量限 取5ng/mL的基质标准溶液，注入液相色谱串联质谱仪，根据信噪比，计算其检出限(S/N=3)和定量限(S/N=10)。结果如表5显示，5种四环素类抗生素的检出限在0.03~0.37 ug/kg 范围之间。5种四环素类抗生素的定量限在0.08~1.13 ug/kg范围之间。检出限、定量限符合 MRLs 和标准的要求。 ·表4 精密度考察结果((n=6) 序号 化合物 检出限(ug/kg) 定量限 、\(ug/kg) 1 去甲金霉 DMCTC 0.03 0.08 2 金霉素 CTC 0.06 0.19 3 强力霉素DC 0.37 1.13 4 四环素 TC 0.06 0.17 5 土霉素 OTC 0.02 0.05 2.5加标回收率 对市售南美白虾进行分析，未检出四环素抗生素成分，添加50 ug/kg 四环素混合标准溶液，按照前述前处理方式处理，上机测定，以外标法定量，计算回收率。5种四环素类加标回收率70.4%~105.1%之间，符合公示稿要求。 表6 回收率 序号 化合物 回收率(%) 去甲金霉 DMCTC 95.5 2 金霉素 CTC 89.7 3 强力霉素DC 73.8 4 四环素 TC 105.1 5 土霉素 OTC 70.4 2 3 2 3 图3 南美白虾质控样品((加标50 ug/kg) 的 MRM 色谱图 结论 本实验使用岛津 LCMS-8045 液质联用系统，参照《GB31656.11-2021食品安全国家标准水产品中土霉素、四环素、金霉素和多西环素残留量的测定》，建立了南美白虾中5种四环素类抗生素含量的检测方法。实验结果表明，5种四环素类抗生素在 5-200 ng/mL的范围内线性良好；精密度实验中，5种四环素类抗生素保留时间的 RSD 分布在0.13%~0.21%之间，峰面积的 RSD 在1.06%~2.82%之间，仪器精密度良好；并且5种四环素类抗生素物质的灵敏度 LOD 在0.03~0.37 ug/kg范围之间， LOQ 在 0.08~1.13 ug/kg 之间，测试结果表明仪器灵敏度良好；符合GB31650-2019关于四环素类抗生素的 MRLs 要求，同时也符合标准的灵敏度LOD=5 ug/kg， LOQ=10 ug/kg 的要求。 岛津应用云 本实验使用岛津LCMS-8045液质联用系统，参照《水产品中土霉素、四环素、金霉素和多西环素残留量的测定（报批稿）》，建立了南美白虾中5种四环素类抗生素含量的检测方法。实验结果表明，5种四环素类抗生素在5-200 ng/mL的范围内线性良好；精密度实验中，5种四环素类抗生素保留时间的RSD分布在0.13%~0.21%之间，峰面积的RSD在1.06%~2.82%之间，仪器精密度良好；并且5种四环素类抗生素物质的灵敏度LOD在0.03~0.37 μg/kg范围之间，LOQ在0.08~1.13 μg/kg之间，测试结果表明仪器灵敏度良好；符合GB 31650-2019关于四环素类抗生素的MRLs要求，同时也符合报批稿的灵敏度LOD=5 μg/kg，LOQ=10 μg/kg的要求。