尼罗罗非鱼鱼肉中多种抗生素残留物检测方案(液相色谱仪)

采用LC/MS/MS同时测定尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus) 中的多种抗生素残留物 应用简报 食品检测和农业 作者 摘要 Sergio Henrique Monteiro 生物学研究所， 圣保罗，巴西 Valdemar Luiz Tornisielo 和 Jeane Gisele Francisco 我们开发和验证了一种同时测定尼罗罗非鱼 (Oreochromis niloticus) 鱼肉中 11种不同类抗生素(氯霉素、土霉素、四环素、金霉素、磺胺地托辛、磺胺噻唑、磺胺二甲嘧啶、恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星和沙氟沙星)的方法。样品预处理过程包括使用5g鱼肉、1mL 0.1 M Na，EDTA溶液和 24mL青腈：水(含0.1%甲酸) (70：30)进行提取，然后通过 Captiva 小柱进行纯化。单次运行中即可完成这些化合物的测定。所有化合物的定量限(LOQ)均低于 4.3 pg/kg， 回收率范围为83.8-110.1%，测量准确度低于 5.5%。 CENA/USP，皮拉西卡巴，巴西 Agilent Technologies 世界上的水产养殖业以每年年9%速度不断在扩大[1]。在巴西，渔产品的增长从2007年到2009年只有60.2%，而罗非鱼产量7年间却增长了105%(2003-2009) [2]。这迫使水产养殖业越来越多地依赖化学药品的投入。由于放养密度很高，生物体间经常互相攻击受伤，导致化学药品需求增加，尤其是抗生素。然而，渔产品进口国如欧共体国家和美国，对抗生素列留制定了越来越严格的限量要求。 由于药物的滥用，动物源性产品中的抗生素残留颇受消费者关注。这些残留可能有毒性，也会使一些敏感个体发生过敏反应。另外，长期摄入食品中低剂量的抗生素也会导致耐药微生物的蔓延。 本研究介绍了一种采用 Captiva 小柱进行化学过滤和 ESI LC/MS/MS分析的快速方法。 Captiva 小柱(部件号 A5300002)的主要优点是可以非常简便高效地去除沉淀蛋白和颗粒物质。 为获得更可靠的结果，使用气代磺胺地托辛-d6作为内标。根据欧盟委员会决议2002/657/EC，对所开发方法的选择性、线性、准确度、基质效应、精密度和灵敏度进行了充分验证[3]。 化学品 所用溶剂甲醇和乙腈为 HPLC 级 (Tedia)。所用用剂甲酸 (Vetec)和Na2EDTA (Sigma-Aldrich) 均为分析级。所用水经过Milli-Q系统(美国密理博)纯化。分析标准品土霉素(97%， OTC)、四环素((97.5%，TC)、金霉素 (93%， CTC)、环丙沙星(99.5%，CFX)、恩诺沙星(99.0%， EFX)、沙氟沙星(97.2%， SAR)、磺胺噻唑 (98.0%， STZ)、诺氟沙星(99%，NFX)，以及内标磺胺地托辛-d6(99.4%) 来自 Fluka Analytical 公司。磺胺地托辛(SDM) 和磺胺二甲嘧啶 (SMZ) 来自 Chem Service公司，纯度均为 99.5%。氯霉素(98.5%， CAP) 来自 Dr. Ehrestorfer 公司。 每个化合物的标准储备液(100ug/mL)用甲醇制备，置于棕色瓶中，在-20℃下可保存6个月。混标工作液(1000 ug/L)通过用水适当稀释储备液来制备，在低于5℃的条件下保存，每周更新。 样品前处理 将5g样品置于50mL螺旋盖聚四氟乙烯管中。加入50pL磺胺地托辛-d6溶液 (1.0ug/mL)作为内标，然后加入1 mL 0.1 M Na，EDTA溶液和24mL乙乙： 水 (70：30，含0.1%甲酸)混合溶剂。该混合物采用 Marconi ultraturrax 分散机(MA102)混匀5 min， 然后采用Hitachi CF16RXII离心机在1370 xg 的离心力下离心5min。采用Manifold Supelco Visiprep 系统，将500uL上清液加入 CaptivaND小柱(部件件A5300002)进行洗脱，洗脱液收集在 2mL样品瓶中，并采用 LC/MS/MS 进行分析。 Agilent 1200 Infinity 系列液相色谱系统 30°C A)0.1%甲酸水溶液 B)0.1%甲酸乙腈溶液 时间 (min) %A %B 0 95 13 5 95 0.4 mL/min 10pL Agilent 6430三重四爷杆液质联用系统 ESI (正) 10 L/min 50 psi 350°C 4000V Agilent Mass Hunter(B.03.01) 多反应监测 (MRM) 验证和定量分析程序 对提出的程序与欧盟委员会决议 2002/657/EC标准进行一致性的验证，主要考虑了以下参数：特异性、检出限(LOD)定量限和LOQ、精密度以及回收率。 在5-400pg/kg 范围内取11个目标化合物的7个不同浓度，采用空白和加标样品进行基质匹配的校准 (MMC)。每个浓度平行分析三次。 采用内标法测定样品中目标化合物的浓度。为获得更可靠的结果，使用气代磺胺地托辛-d6作为内标。 结果与讨论 每个化合物的监测离子见表1。响应强度最高的离子对作为定量离子，第二高的离子对作为定性离子，用于分析确证。 表1. 所选化合物的保留时间(RT) 和MS/MS条件 化合物 RT (min) 母离子 子离子 碎裂电压(V) 碰撞能量(V) 金霉素 10.610 479.1 462.2* 12 479.1 444.1** 17 土霉素 9.685 461.2 426* 16 461.2 201.1** 41 四环素 9.944 445.2 410.2* 17 445.2 154.2** 115 30 磺胺地托辛 11.982 311.1 156* 16 311.1 108** 28 磺胺二甲嘧啶 10.127 279.1 186* 12 279.1 156** 16 磺胺噻唑 9.128 256 156* 90 8 256 108** 90 20 环丙沙星 9.786 332.1 288.1* 13 332.1 245.1** 22 恩诺沙星 10.021 360.2 342.2* 132 17 360.2 316.2** 132 16 诺氟沙星 9.695 320.1 302.1* 20 320.1 231.0** 44 沙氟沙星 10.560 386.1 342.1* 119 15 386.1 299.1** 119 26 氯霉素 11.563 323 305* 70 0 323 275** 70 8 磺胺地托辛-d6 11.945 317.1 162.2* 65 20 317.1 108.1** 65 28 *定量离子对 **定性离子对 粗体标识化合物为内标。 采用保留时间和两个 MRM 离子对对抗生素残留进行鉴定。使用所选离子对分析得到的化合物色谱图见图1。 ×104 Captiva 小柱的主要优点是可用于简便高效地去除沉淀蛋白和颗粒物质。通过考察方法的选择性来论证该优点，并且通过进样空白鱼样品(不含抗生素)和加标抗生素样品提取物进行验证。空白鱼样品分析表明，定量限(LOQ)实际为 5 pg/kg时，选用与那些化合物相同、且呈现最佳选择性的保留时间处，测得干扰低于10%。 基质中所有化合物在5-400 pg/kg 的浓度范围内线性关系良好，测得的决定系数(R2)均大于0.99(见表2)。图2展示了采用该方法分析尼罗罗非鱼基质中药物所得结果的一个实例。 图1.加标鱼样品(100 pg/kg) 的总离子流色谱图 (TIC)。 该结果还说明宽浓度范围的分析可以有效检出鱼样品中的抗生素，并且校准曲线上数据点的离差低于10%。校准曲线的制备、信噪比和相关计算由 Agilent MassHunter 软件(B.03.01)来完成。 表2. 尼罗罗非鱼鱼肉中抗生素分析的 LOD、 LOQ 和测定的决定系数(R²) 表2所示的 LOD 和 LOQ完全满足鱼肉中抗生素的分析。 金霉素 0.91 3.00 0.9992 土霉素 1.20 4.00 0.9994 四环素 1.00 3.20 0.9994 磺胺地托辛 0.30 0.90 0.9995 磺胺二甲嘧啶 0.80 2.56 0.9992 磺胺噻唑 1.30 4.00 0.9990 环丙沙星 0.40 1.20 0.9994 恩诺沙星 0.50 1.50 0.9976 诺氟沙星 1.30 4.30 0.9992 沙氟沙星 0.60 1.90 0.9986 氯霉素 1.00 3.50 0.9992 ×10- A B 5- 氯霉素 y=0.0012x-0.0038 4- R2=0.99925484 32 1- 0 0 40 80 120 160 200 240280320360 400 浓度(ug/kg) C 四环素 1.6 y=0.0043x-0.0080 R2=0.99936178 1.2 30.8- 0.4 0 ●—0- 40 80 120 160 200240280 320 360 400 浓度(pg/kg) E 7 磺胺地托辛 1-磺胺噻唑 y=0.0026x-1.5309E-4 0.8-R2=0.99902020 0.6 -0.4 0.2- 0 400 40 80 120 160 200240 280 320 360 400 浓度(pg/kg) 3.2 H 2.8-恩诺沙星 y=0.0075x-0.0028 2.4- R2=0.99763223 2.0- 1- 1.2- 0 40 80 120 160200240 280 320 360 400 浓度 (ug/kg) 图2. 鱼样品中氯霉素(A)、土霉素(B)、四环素(C)、金霉素(D)、磺胺地托辛(E)、磺胺噻唑(F)、磺胺二甲嘧啶(G)和恩诺沙星(H)的校准曲线，浓度范围5.0-400pg/kg。接下页 通过分析加标浓度分别为 50、100和 200 pg/kg 的尼罗罗非鱼鱼肉样品，评价方法的精密度和以回收率表示的准确性。通过平行7次测定上述浓度样品，考察了方法的日内精密度。结果见表3. 在系统经30天常规运行，通过对100 pg/kg浓度样品重复7次测定，确定了方法的日间精密度。结果介于2.8和10.3%之间，可以接受。 表3. 三个加标浓度鱼肉样品的百分回收率和日内精密度(相对标准偏差)，以及浓度100 pg/kg 样品的日间精密度 化合物 50 pg/kg RSD (%) 100 pg/kg RSD (%) 200 pg/kg RSD(%) RSD (%) 金霉素 108.1 3.7 100.8 4.5 87.5 7.7 6.1 土霉素 103.8 4.6 96.8 11.5 86.3 8.3 8.5 四环素 106.4 4.5 107.1 5.4 93.0 7.4 6.2 磺胺地托辛 86.5 6.0 89.3 9.3 96.0 4.8 7.8 磺胺二甲嘧啶 99.3 4.1 94.9 7.7 97.6 5.0 5.6 磺胺噻唑 92.5 3.3 92.3 7.2 95.8 5.8 7.7 环丙沙星 87.9 6.5 87.2 8.6 82.8 6.2 9.1 恩诺沙星 98.4 6.6 108.8 4.7 95.4 8.3 8.5 诺氟沙星 96.0 10.6 100.0 9.4 87.5 5.1 7.8 沙氟沙星 98.1 3.0 90.0 5.4 90.7 4.4 4.7 氯霉素 93.2 5.2 90.5 13.2 94.5 5.5 10.3 通过加标样品中检出分析物的量与加标量的比值来计算回收率，以百分率表示。经证实，所开发的方法精度好、准确度高，能可靠用于抗生素的测定。 结论 本文详述了尼罗罗非鱼鱼肉中选择性测定不同种类抗生素的方法开发。方法采用三重四极杆液质联用系统，具有很高的准确度、精密度和灵敏度。它可以对渔场中低至 ppb 级的目标化合物进行鉴定和定量分析。 拟定的提取程序非常简单，样品处理不需要附加净化步骤即可获得满意回收率。 ( 参考文献 ) ( 1. F AO， 2009. State of world fisheries and aquaculture. FAOFisheries and Aquaculture Department. Rome. 176 p ) 2. ( Brasil， 2013. Ministerio da Agricultura， Pecuaria e Abastecimento.Avaliable at http：//www.agricultura.gov.br/animal/qualidade-dos- alimentos/residuos-e-contaminantes. Accessed in 08 October 2013 ) 3. Commission Decision，2002.2002/657/EC of 12 August2002 Off. J. Eur. Commun. L221， 8-36 更多信息 www.agilent.com/chem/cn 这些数据代表典型结果。有关我们的产品和服务的详细信息，请访问我们的网站： www.agilent.com/chem/cn 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 本资料中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 C安捷伦科技(中国)有限公司， 2013 ( 2013年12月18日，中国印刷 ) 5991-3768CHCN Agilent Technologies 摘要我们开发和验证了一种同时测定尼罗罗非鱼 (Oreochromis niloticus) 鱼肉中 11 种不同类抗生素（氯霉素、土霉素、四环素、金霉素、磺胺地托辛、磺胺噻唑、磺胺二甲嘧啶、恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星和沙氟沙星）的方法。样品预处理过程包括使用 5 g 鱼肉、 1 mL 0.1 M Na2EDTA 溶液和 24 mL乙腈：水（含 0.1% 甲酸）(70:30) 进行提取，然后通过 Captiva 小柱进行纯化。单次运行中即可完成这些化合物的测定。所有化合物的定量限 (LOQ) 均低于 4.3 µg/kg，回收率范围为 83.8 - 110.1%，测量准确度低于 5.5%。前言世界上的水产养殖业以每年约9% 速度不断在扩大。在巴西，渔产品的增长从2007 年到2009 年只有60.2%，而罗非鱼产量7 年间却增长了105% (2003–2009) 。这迫使水产养殖业越来越多地依赖化学药品的投入。由于放养密度很高，生物体间经常互相攻击受伤，导致化学药品需求增加，尤其是抗生素。然而，渔产品进口国如欧共体国家和美国，对抗生素残留制定了越来越严格的限量要求。由于药物的滥用，动物源性产品中的抗生素残留颇受消费者关注。这些残留可能有毒性，也会使一些敏感个体发生过敏反应。另外，长期摄入食品中低剂量的抗生素也会导致耐药微生物的蔓延。本研究介绍了一种采用Captiva 小柱进行化学过滤和ESI LC/MS/MS 分析的快速方法。Captiva 小柱（部件号A5300002）的主要优点是可以非常简便高效地去除沉淀蛋白和颗粒物质。为获得更可靠的结果，使用氘代磺胺地托辛-d6 作为内标。根据欧盟委员会决议2002/657/EC，对所开发方法的选择性、线性、准确度、基质效应、精密度和灵敏度进行了充分验证。结论本文详述了尼罗罗非鱼鱼肉中选择性测定不同种类抗生素的方法开发。方法采用三重四极杆液质联用系统，具有很高的准确度、精密度和灵敏度。它可以对渔场中低至ppb 级的目标化合物进行鉴定和定量分析。拟定的提取程序非常简单，样品处理不需要附加净化步骤即可获得满意回收率。