水产品中四环素类化合物检测方案(浓缩仪)

三/Raykol自动化样品前处理解决方案-RK-2019-F007 解决方案 水产品中四环素类化合物的测定解决方案 关键词 全自动固相萃取；均质器；浓缩仪；高效液相色谱-串联质谱法；四环素抗生素 介绍 四环素类抗生素(图1)是由放线菌产生的一类广谱抗生素，由于实用性高且价格低廉，在畜禽养殖和饲料添加剂等方面得到了广泛的应用。近年来，我国水产养殖业发展迅速，鱼类疾病越来越复杂，渔药和抗生素饲料添加剂的使用量也日渐增加。由于药物滥用，导致了水产品中有大量的抗生素残留，严重影响了水产品的质量安全。如果人类长期食用这种抗生素残留的水产品，可能导致牙齿变黄，形成“四环素牙”，甚至会使指甲和巩膜变色，对身体健康产生严重伤害。 本实验参考国标GB/T21317-2007《动物源性食品中四环素类兽药残留量检测方法液相色谱-串联质谱法与高效液相色谱法》，建立了基于Raykol IFotector Plus固相萃取分析水产品中四环素类抗生素的检测方法。 图1.四种四环素类抗生素结构图 1.仪器与试剂 Raykol Auto Prep 200 全自动液体样品处理工作站 Raykol Fotector Plus 高通量全自动固相萃取仪 Raykol AH-30全自动均质器 Raykol MPE 高通量真空平行浓缩仪 Raykol AutoEVA-60 全自动平行浓缩仪 Agilent 1260 高效液相色谱(HPLC)， Agilent6410 质谱检测器(MS) HLB固相萃取柱 (RayCure HLB， 500 mg/6mL， 甲醇(优级纯)，水； Na，EDTA (0.1 mol/L) -McIlvaine (0.1M)缓冲溶液(pH4.0)， 准确60.2g乙二胺四乙酸二钠，磷酸氢二钠17.8 g和柠檬酸21.0 g与烧杯中，加入1000 mL的纯净水，加入浓盐酸调节 pH值至4.0。 2.标准溶液的配制 将1000.0 Hg/mL 的单标储备液取出，于室温平衡后用 Auto Prep 200 全自动液体样品处理工作站配成浓度为0.02、0.04、0.10、0.20、0.50 Hg/mL的标准工作曲线。 9 方法结束 3.1提取 方法1：称取5g匀浆好的新鲜鱼肉样品于50mL离心管中，分别用20 mL、20 mL、10 mL上述Na，EDTA-McIlvaine缓冲液漩涡1min， 冰水浴超声10 min，提取三次；3000 r/min 离心后合并上清液，定容至50mL， 混匀。再次以6000 r/min 离心(温度低于15℃)，用快速滤纸过滤；准确量取10 mL上清液转移至 Fotector Plus 高通量全自动固相萃取仪上样瓶中待净化。 方法2：准确称取搅碎后的新鲜鱼肉样品5.0g于50 mL离心瓶中，加入2.0g无水硫酸钠，加入20 mL乙腈进行提取，用 AH-30全自动均质器均质1.0 min， 4000 rpm 离心5.0 min， 取上清液于250mL 分液漏斗中。残渣用20 mL 乙腈重复提取一次，合并2次提取液。往分液漏斗中加入20 mL乙腈饱和的正己烷，振摇20s， 静置取下层乙腈溶液。将 所得乙腈溶液于MPE 高通量真空平行浓缩仪浓缩至近干，加入10mL 的 Na，EDTA(0.1 mol/L)-McIlvaine(0.1M)缓冲溶液(pH=4.0)，摇匀备用。 3.2固相萃取净化条件 全自动固相萃取仪 Fotector Plus高通量全自动固相萃取仪 固相萃取柱 HLB (RayCure， 500 mg/6 mL) 活化 甲醇 淋洗 pH 4.0甲酸水溶液 洗脱 甲醇溶液 3.3净化 分别以5mL甲醇和5mL水活化 HLB柱 (Oasis500 mg/6 mL)后，将上述提取液以1 mL/min 的速度进行上样，并用3mL水清洗样品瓶。以5 mL水和5mL 5%甲醇水对固相萃取柱进行淋洗。在20 psi的氮气流下吹干 HLB柱，最后以10 mL 甲醇洗脱目 标化合物(具体的净化步骤请见图2)。将所得洗脱液在 AutoEVA-60 全自动平行浓缩仪上浓缩至近干， 以30%甲醇水溶液定容至1mL，上机测试。 序号 命令 溶剂 排出 ，流速(mL/min) 体 时间(min) 1 清洗样品通道 CH30H 4.3 2 活化 CH30H 有机废液 5 5 1.4 3 活化 H20 有机废液 5 5 1.4 4 上样 有机废液 1 10 10.8 5 清洗样品瓶 H20 有机废液 60 3 3.8 6 淋洗 H20 有机废液 2 5 2.9 7 淋洗 5%CH30H-H20 有机废液 2 5 2.9 8 气推 有机废液 80 10 0.9 9 吹干 5 10 清洗注射泵 CH30H 40 5 0.6 11 洗脱 CH30H 收集 2 10 5.6 12 气推 收集 80 10 0.9 13 结束 14 图2.Fotector Plus 四环素固相萃取净化方法 4.检测条件 4.1色谱柱条件 柱子 Waters XBridge BEH HILIC 2.5pm×2.1 mm×50mm 流速 0.200 mL/min 流动相 A： 10mM ammonium acetic (0.1% formic acid)， B： Methanol 柱温 35℃ 进样体积 10uL 检测器 Agilent 6410 离子模式 ESI 吹扫气 11 L/min 氮气温度 350℃ 簇电压 4000 雾化压力 35 psi 梯度洗脱 0.0-0.50 min，80%流动相A； 0.50-2.0 min， 30%流动相A； 2.0-4.0min， 30%流动相A； 4.00-4.10min， 90%流动相A； 4.10-7.0min， 90%流动相A。 4.2 MRM 参数 表1.4种四环素的串联质谱检测参数 Compound Name PrecursorIon Product Ion Dwell Fragmentor Collision Energy Cell AcceleratorVoltage 四环素 445.2 427.1 40 120 6 7 410.1 40 120 14 7 154 40 120 26 7 土霉素 461.2 443.2 40 115 8 7 426.1 40 115 12 7 金霉素 479.2 444.1 40 120 18 7 462 40 120 12 7 强力霉素 445 428.1 40 125 14 7 321.1 40 125 30 7 267.1 40 125 38 7 4.3 MRM色谱图 下图为四种四环素类化合物标准溶液在液质上的质谱图： 5.样品测试 拟合出工作曲线，要求R>0.995；此曲线两周需要重新配置一次。 5.1基质效应验证 5.2样品基质加标测试 为了消除基质带来的离子抑制对定量测定的影响，需用空白样品提取液来配制标准工作曲线。如果基质加标浓度准确，则可以直接用标准曲线对样品进行定量；如果不准确，请使用基质加标做工作曲线进行定量。 选择定量离子的峰面积作为纵坐标，浓度作为横坐标，做相关曲线，曲线为线性回归，各点权重相等， 为了验证该方法的回收率，本实验向新鲜鱼肉样品(5g)中加入上述4种四环素类标准品(40uL，1 mg/L)， 进行加标回收验证(n=3)。测试结果如表-2所示，4种四环素回收率在75-115%之间， RSD值均控制在10%以内。说明该方法能够很好地运用于水产品中4种四环素的检测。 表2.新鲜鱼肉中的加标回收率及RSD 值(401ug/kg) 化合物 (Compound) 回收率(%)样品-1 Sample-1 回收率(%) 样品-2 Sample-2 回收率(%) 样品-3 Sample-3 平均回收率 AverageRecoveries (%) RSD (%) 四环素 111.94 102.13 113.26 109.11 5.57 土霉素 110.84 94.31 107.82 104.32 8.44 金霉素 78.67 76.70 79.70 78.36 1.95 强力霉素 76.61 87.95 80.38 81.65 7.08 6.结果与结论 6.1样品提取过程中可以采用两种方式进行提取，但最终都必须以 Na，EDTA-McIlvaine 缓冲液进行 pH 值调节后，方可进行固相萃取柱净化。否则四环素类化合物容易与样品中含有的微量金属元素络合，导致其在固相萃取柱上无法保留，最终使得加标回收率较低。 6.2对于洗脱液的氮吹应控制在近干状态，不可氮吹至干，否则容易导致回收率较低。 7.解决方案的优势 睿科 AH-30全自动均质器实现多任务的高通量均质，完全取代了手动均质的过程。一次最多处理32个样品，大大提高工作效率。 睿科 Auto Prep 200 全自动液体样品处理工作站能够实现混标制备、标准曲线制备、样品添加和分液等液体样品处理功能，全程无需人员值守，极大减轻工作量并且保护实验人员的身体健康；同时仪器程序化运行可以有效避免人为误差，保证曲线的精密性和准确性。 Fotector Plus 高通量全自动固相萃取仪采用全自动操作，可以排除人员操作带来的误差，从活化到上样、洗脱一步到位，六通道同时进行；同时Fotector Plus 能够实现高通量处理，最多一天能够处理180个样品，省时省力，真正为批量检测提供帮助。 MPE 真空平行浓缩仪/AutoEVA-60 全自动平行浓缩仪，大大地提高了样品前处理效率，真正完全解放实验室人员劳动。 RayKol 睿科集团股份有限公司 RayKol Group Corp.， Ltd. 网址： www.raykol.com 电话：400-885-1816 邮箱： info@raykol.com 本文中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知 @睿科集团股份有限公司 2020年5月版 邮箱： info@raykol.com网址：www.raykol.com热线： 网址：www.raykol.com邮箱： info@raykol.com热线： 本实验参考国标GB/T 21317-2007《动物源性食品中四环素类兽药残留量检测方法 液相色谱-串联质谱法与高效液相色谱法》，建立了基于Raykol Fotector Plus固相萃取分析水产品中四环素类抗生素的检测方法。