中药材莲子中黄曲霉毒素检测方案(液相色谱仪)

SSL-CA22-021Excellence in Science Excellence in ScienceLC-272 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD. -Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cn Tel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn 岛津 Essentia 黄曲霉毒素分析系统测定中药材莲子中的黄曲霉毒素 LC-272 摘要：本文按照2020年版《中国药典》四部2351真菌毒素测定法中黄曲霉毒素测定法(第一法)，采用岛津 Essentia 黄曲霉毒素分析系统对莲子中黄曲霉毒素进行方法建立和测定。以外标法定量，4种黄曲霉毒素在各自浓度范围内标准曲线线性良好，相关系数r 均大于0.999，准确度在95.5~102.4%之间。对加标样品溶液连续进样6次，重复性结果(RSD% 表示)显示，4种黄曲霉毒素的保留时间 RSD%在0.06~0.08%之间，峰面积的RSD% 在0.55~1.01%之间，加标回收率在78.7~95.0%之间。上述结果表明，该方法准确度高，重复性好，可为莲子中黄曲霉毒素的测定提供参考。 关键词：2020年版《中国药典》 黄曲霉毒素 柱后碘衍生法 黄曲霉毒素(AF) 是黄曲霉和寄生曲霉的代谢产物，具有极强的毒性和致癌性，可引发动物的肝癌、肾癌、胃癌等，其中以黄曲霉毒素B1最为多见，其毒性和致癌性也最强。免疫亲和柱是将特异性的黄曲霉毒素单克隆抗体与载体蛋白偶联并填柱而成，能特效性地、高选择性地吸附黄曲霉毒素，而让其它杂质通过柱子，使样品得以纯化，黄曲霉毒素吸附后可被极 性有机溶剂洗脱。免疫亲和柱将提取、净化、浓缩一次完成，大大简化了前处理过程，提高了方法的准确度、精密度和灵敏度。本研究参考2020年版《中国药典》，采用岛津Essentia 黄曲霉毒素分析系统对莲子中黄曲霉素B1、B2、G1、G2进行测定。 本文使用岛津Essentia 黄曲霉毒素分析系统，配置信息如下： 系统控制器： CBM-20Alite自动进样器：SIL-16柱温箱： CTO-16L输液泵：LC-16×3脱气机： DGU-20As化学反应箱：CRB-40检测器：RF-20A色谱工作工： LabSolutions Ver. 5.98 1.2分析条件 色谱柱： WondaSil C18((250 mm×4.6 mm l.D.， 5 um) 流动相：甲醇-乙腈-水(20：25：55，v：V：V) 流速：0.8 mL/min进样体积：5uL 洗脱方式：等度洗脱 柱温：40℃ 检测波长： Ex=360nm，Em=450nm 衍生溶液：0.05%碘溶液(取0.5g碘，加甲醇100mL，用水定容至1000 mL) 衍生液流速：0.3mL/min 衍生化温度：70℃ 样品前处理 对照品溶液的制备：精密量取黄曲霉毒素混合对照品溶液(黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2标识浓度分别为1 ug/mL、0.3ug/mL、1 pg/mL、3 ug/mL) 0.5 mL，置10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为储备溶液1，精密量取储备溶液1200uL 置5mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为工作溶液。 供试品溶液的制备：参照2020年版《中国药典》四部2351真菌毒素测定法中黄曲霉毒素测定法(第一法)供试品溶液的制备方式制得。 结果与讨论 3.1系统适用性 按照1.2中分析条件进行测定，对照品色谱图如图1所示，结果见表1(药典中规定，两个相邻色谱峰的分离度应大于1.5。)。 图1 对照品溶液色谱图(进样量5uL) 表1 系统适用性溶液测定结果 # 化合物 分离度 分离度(标准要求) AFB1 >1.5 2 AFB2 2.9 3 AFG1 1.9 4 AFG2 3.7 3.2线性 将对照品溶液按照1.2分析条件进行测定，依据药典规定分别吸取黄曲霉毒素混合标准溶液5 uL、10uL、15 uL、20uL、25 uL注入液相色谱仪，外标法定量。。以进样量(pg)为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，进行线性回归分析，在线性测定范围内，线性良好，线性相关系数均>0.999， 准确度在95.5-102.4%之间，线性方程、相关系数见表2。LabSolutions 工作站信噪比自动计算检出限(S/N=3)及定量限(S/N=10)见表2。 表2 黄曲霉毒素标准曲线 线性范围 准确度 相关系数 检出限 定量限 # 化合物 \pg) 校准曲线 (%) (pg) (pg) 1 AFB1 10-50 Y=(2486.76)X+(-555.325) 98.4-101.1 0.9999 0.37 1.11 2 AFB2 3-15 Y=(3711.27)X+(1116.72) 98.0-101.0 0.9999 0.22 0.67 3 AFG1 10-50 Y=(1921.41)X+(41.5114) 97.0-101.8 0.9998 0.43 1.30 4 AFG2 3-15 Y=(2125.62)X+(123.683) 95.5-102.4 0.9996 0.34 1.04 图2黄曲霉毒素校准曲线 3.3精密度 按照1.2分析条件，取样品加标溶液重复测试6次，并计算各化合物保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD%))，结果显示 RSD 分别在 0.06~0.08%和0.55~1.01%之间，表明该系统精密度良好。 表3 精密度实验结果(1(n=6) # 化合物 RSD% 保留时间 峰面积 AFB1 0.07 1.01 2 AFB2 0.08 1.00 3 AFG1 0.06 0.92 4 AFG2 0.07 0.55 3.4方法回收率 取空白莲子样品进行加标，按照1.2步骤制备样品和加标样品，加标浓度为黄曲霉毒素B1和G1为1ug/kg， 黄曲霉毒素 B2和 G2 为 0.3 ug/kg， 加标样品平行测定3次。测试结果显示：各目标物平均加标回收率在78.7~95.0%之间，相对标准偏差在0.71~1.44%之间，说明本方法准确性良好。 按照1.2中分析条件进行测定，空白样品色谱图如图3所示，加标回收率结果见表4。 图3 空白样品溶液和样品加标回收率重叠色谱图(进样量5uL) 表4 加标回收实验结果(n=3) # 名称 平均回收率(%) RSD(%) 1 AFB1 84.1 0.81 2 AFG1 95.0 1.44 3 AFB2 78.7 0.71 4 AFG2 95.0 1.41 结论 本研究采用岛津 Essentia 黄曲霉毒素分析系统对莲子中黄曲霉毒素进行测定。按照2020年版《中国药典》四部中2351真菌毒素测定法中黄曲霉毒素测定法(第一法)进行方法建立和测定。实验结果表明，系统适用性试验、专属性、线性及精密度试验结果均符合规定，系统稳定性良好、结果准确度高。该方法为制药药检相关行业检验检测工作提供了参考。 岛津应用云 本研究采用岛津Essentia黄曲霉毒素分析系统对莲子中黄曲霉毒素进行测定。按照2020年版《中国药典》四部中2351真菌毒素测定法中黄曲霉毒素测定法（第一法）进行方法建立和测定。实验结果表明，系统适用性试验、专属性、线性及精密度试验结果均符合规定，系统稳定性良好、结果准确度高。该方法为制药药检相关行业检验检测工作提供了参考。