补骨脂中33种农残检测方案

高色素高油脂终极之王——中药补骨脂的33种农残测定分析 背景 c又名黑故子、破故纸，为豆科植物补骨脂 Psoralea corylifolia L.的干燥成熟果实。据报道，补骨脂含挥发油约20%、还含有碱溶性树脂、不挥发性萜类油、有机酸、香豆素、黄酮和皂苷等成分。近期很多中药检测企业反馈补骨脂中药农残测定非常难常， GCMSMS 分析中化合物干扰大且色谱柱污染较为严重极易造成目标物丢峰，同样 LCMSMS分析中也有个别化合物干扰导致的丢峰，常规的固相萃取法一、固相萃取法二、固相萃取法三都无法解决。针对以上含重色素、挥发油和树脂的样品分析存在的问题，纳谱分析优化了 HLB 产品对于挥发油和树脂的吸附能力。相比常规固相萃取产品，优化后的 HLB 柱可以吸附更多色素、挥发油、树脂类成分，从而降低了样品中色素对色谱柱的污染和树脂挥发油类照成丢峰拖尾的基质效应，有效的提高了补骨脂样品分析时仪器的灵敏度。。今天，我们来看看补骨脂项目的前处理效果吧。 补骨脂药材 适用范围 本方法参考中国药典2020版2341第五法中的固相萃取法2，前处理方法做了部分调整，适用于含有挥发油类基质干扰大和色素较多的中药材农残检测。 实验步骤 对照品溶液的制备 1.1混合对照品配制 精密量取禁用农药混合1mL， 置20mL量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，备用； 1.2气相色谱-串联质谱法分析用内标溶液的制备 取磷酸三苯酯对照品适量，精密称定，加乙腈溶解并制成每 1mL 含 1.0mg的溶液，即得。精密量取适量，加乙腈制成每1mL 含 0.1ug的溶液。 1.3空白基质溶液的制备 取空白基质样品，同供试品溶液的制备方法处理制成空白基质溶液。 1.4 基质混合对照溶液的制备 分别精密量取空白基质溶液1.0mL(6份)，置氮吹仪上，40℃水浴浓缩至约 0.6mL，分别加入混合对照品溶液 10uL、20pL、50uL、100pL、150uL、200pL，加乙腈稀释至1mL，涡旋混匀，即得。 2 供试品溶液的制备 2.1提取 精密称取 5g样品(3号筛)，加氯化钠1g，加入50mL乙腈，匀浆处理2分钟，离心后分取上清液，残渣再加50mL 乙腈，匀浆处理1分钟，离心后，合并两次提取上清液，减压浓缩至3~5mL，加乙腈定容至10mL，摇匀，置-20℃冷藏3h 或家用冰箱冷藏过夜，取出冷冷离心，分取所有上清液置离心管中，摇匀，待净化。 3 净化 GCMSMS 样品： SPE 柱： SelectCore HLB-C 固相萃取柱 500mg/6mL 净化：取 SelectCore HLB-C固相萃取柱 500mg/6mL小柱，加乙腈5mL活化，再取补骨脂提取液 2mL置已活化的 SelectCore HLB-C 固相萃取柱中，收集样品液，待所有样品液进入柱体填料后，取5mL乙腈洗脱，合并样品液与洗脱液，氮吹至2mL即得。 GC/MS/MS测定：精密量取过固相萃取柱氮吹定容后的溶液 1mL，氮吹至 0.4mL 加入混合对照溶液，乙腈定容至1mL， 再加入0.3 mL 磷酸三苯酯溶液，混匀，过 0.22um尼龙针式过滤器，上机分析。 注意事项：样品洗脱定容后只有2mL，故需要配置6个浓度点标准曲线时可合并5次分别5根SelectCoreHLB-C固相萃取柱 500mg/6mL小柱净化的样品液与洗脱液，40℃以下减压回收至 5mL， 转移至 10mL容量瓶，再取适量乙腈冲洗减压回收瓶并入样品液，定容至10mL。如若做快速样品筛查时可直接将净化的样品液与洗脱液并入10mL 已校准的刻度具塞试管中氮吹至2mL即得。 LCMSMS 样品： SPE 柱： SelectCore HLB 固相萃取柱 500mg/6mL； 30/pkg 净化：量取补骨脂提取液 3mL， 过 SelectCore HLB 固相萃取柱 500mg/6mL，收集全部净化液，混匀，即得。 LC/MS/MS测定：精密量取过固相萃取柱后溶液1mL氮吹至0.4ml 加入混合对照品液，乙腈定容至1mL，再加入0.3mL水，混匀，过 0.22um尼龙针式过滤器，上机分析。 4 气相色谱-串联质谱法(岛津 GC-MS -TQ8040 NX) 色谱条件 色谱柱： SHIMADZU SH-Rxi-17SilMS， 30mx0.25mm， 0.25um； 进样口温度：250℃； 升温程序：初始温度为60℃，保持 1min； 以10℃/min升温至160℃；再以2℃/min升温至230℃，最后以15℃/min 升温至300℃，保持6min； 载气：高纯氦气(纯度>99.999%)； 进样方式：：不分流进样； 恒压模式：146kPa： 进样量：.11uL. 质谱条件 电离方式：：电子轰击电离源(EI)； 电离能量：70Ev： 接口温度：250℃； 离子源温度：250℃； 监测方式：多反应检测模式(MRM)； 溶剂延迟：：10.0min。 GCMSMS 监测目标物注意事项： 挥发油类基质中：氟虫腈类化合物偶见飘逸、可采取 LCMSMS 监测提高实验效率。 补骨脂基质中氟甲腈、氟虫腈、氟虫腈亚砜、内吸磷、甲基异柳磷、久效磷、水胺硫磷采用 LCMSMS 监测结果， GCMSMS 可不监测以上化合物。 甲基对硫磷药典配套参考离子对响应低可选用：125.0>47.0CE： 10作为参考离子对，响应较高。 α-硫丹定量离子为：240.80>205.60 参考离子为：：194.80>159.00 除草醚定量离子为：282.80>253.00 参考离子为：282.80>201.80 对硫磷定量离子为： 139.00>109.00 参考离子为：291.00>81.00 5 高效液相色谱-串联质谱法(岛津LC-MS 8045) 色谱条件 色谱柱： ChromCore C18-MS Pesticides 中药农残专用柱(2.1x100mm， 2.6um) 流动相： A：0.1%甲酸水溶液(含有5mmol/L甲酸铵) B：乙腈-0.1%甲酸水溶液(含有5mmol/L 甲酸铵)=95：5 流速：0.3mL/min 柱温：40℃ 进样羊：2 uL 梯度： 时间(min) 流速(mL/min) 流动相A(%) 流动相B(%) 0 0.3 70 30 1 0.3 70 30 12 0.3 0 100 14 0.3 0 100 14.1 0.3 70 30 16 0.3 70 30 质谱条件 离子源：电喷雾离子源(Electrospray ionization， ESI)正离子扫描 监测方式：多反应监测(Multiple Reaction Monitoring， MRM) 离子源接口电压： 4.5kV 雾化气：氮气3.0L/min 加热气： 干燥空气 10.0L/min DL 温度：250℃ 加热模块温度：400C 接口温度：300℃ 干燥气： N210 L/min LCMSMS 监测目标物注意事项： 目标物 定量离子 CE电压 参考离子 CE电压 msec 保留时间(参考) 氟虫腈 434.90>81.00 15 434.90>249.80 30 5 7.341 氟甲腈 386.90>350.80 10 386.90>281.80 35 5 7.656 氟虫腈砜 450.90>281.80 30 450.90>243.80 66 5 8.093 氟虫腈亚砜 419.10>383.10 10 419.10>262.10 27 5 8.103 水胺硫磷 291.00>231.00 -15 291.00>121.00 -30 5 5.106 以上目标物中氟虫腈类化合物均为负离子模式采集，水胺硫磷为正离子模式采集。 由于分析化合物多，且存在正负离子模式同时采集，为提高仪器灵敏度可采用分段采集模式进行，分段采集可设置测定时间为各目标物保留时间前 0.5min 开始-目标物保留时间后 0.5min 结束。 挥发油基质样品自动进样器托盘温度不宜过低，否则个别样品会出现分层，导致分析结果不准确，建议25℃为宜。 表1补骨脂中33种农药残留的的测定添加回收结果(%) 农残成分 回收率 农残成分 回收率 农残成分 回收率 甲胺磷 76.8% 地虫硫磷 83.9% 涕灭威砜 103.5% 甲基对硫磷 84.5% 硫线磷 109.5% 涕灭威亚砜 91.0% 对硫磷 102.7% 蝇毒磷 89.5% 灭线磷 83.1% 久效磷 102.5% 治螟磷 83.8% 氯唑磷 101.1% 磷胺 109.5% 特丁硫磷 87.4% 水胺硫磷 83.6% α-六六六 84.1% 特丁硫磷砜 98.4% α-硫丹 88.2% β-六六六 83.3% 特丁硫磷亚砜 88.4% β-硫丹 85.0% y-六六六 83.9% 甲基硫环磷 66.5% 硫丹硫酸酯 90.6% 8-六六六 83.3% 甲磺隆 88.2% 氟虫腈 91.8% 2.4'-滴滴涕 76.6% 氯磺隆 73.5% 氟虫腈砜 86.7% 4，4'-滴滴滴 83.7% 胺苯磺隆 71.4% 氟虫腈亚砜 98.5% 4，4'-滴滴涕 79.2% 甲拌磷 81.3% 氟甲腈 100.8% 4，4'-滴滴伊 75.3% 甲拌磷砜 86.8% o，p'-三氯杀螨醇 77.2% 杀虫脒 80.9% 甲拌磷亚砜 88.9% p，p'-三氯杀螨醇 80.2% 除草醚 86.6% 甲基异柳磷 91.7% 硫环磷 88.5% 艾氏剂 77.3% 内吸磷 85.5% 狄氏剂 76.5% 苯线磷 70.5% 克百威 91.7% 苯线磷砜 100.9% 3-羟基克百威 78.3% 苯线磷亚砜 82.3% 涕灭威 87.1% 6处理后溶液的颜色比对 GCMS/MS样品： 从左至右分别是补骨脂提取液、补骨脂提取液过常规固 3 SPE 柱、补骨脂提取液过 SelectCore HLB-C 固相萃取柱 500mg/6mL LCMS/MS 样品： 从左至右分别是补骨脂提取液、补骨脂提取液过常规固2SPE柱、补骨脂提取液过 SelectCore HLB 固相萃取柱 500mg/6mL 7补骨脂 GCB/NH2柱与 HLB-C柱净化的 CGMSMS 数据分析图 常规固3净化(TIC图) HLB-C净化(TIC图) 对硫磷(左边为固3净化样品，右边为 HLB-C 净化样品) 甲基对硫磷(左边为固3净化样品，右边为 HLB-C净化样品) OP-三氯杀螨醇(左边为固3净化样品，右边为 HLB-C净化样品) PP-三氯杀螨醇(左边为固3净化样品，右边为 HLB-C 净化样品) 苯线磷(左边为固3净化样品，右边为 HLB-C 净化样品) 0-硫丹(左边为固3净化样品，右边为 HLB-C净化样品) 补骨脂常规 HLB 柱与 SelectCore HLB 固相萃取柱 500mg/6mL 净化的 LCMSMS数据分析图 苯线磷砜(左边为常规HLB 净化样品，右边为 SelectCore HLB 固相萃取柱 500mg/6mL 净化样品) 治螟磷(左边为常规HLB净化样品，右边为 SelectCore HLB固相萃取柱 500mg/6mL 净净样品) 特丁硫磷砜(左边为常规HLB净化样品，右边为 SelectCore HLB 固相萃取柱 500mg/6mL 净化样品) ** 千米 水胺硫磷(左边为常规 HLB 净化样品，右边为 SelectCore HLB 固相萃取柱 500mg/6mL 净化样品) 381818888512188888(+)312.191.0000>121.1000(+)312.1000=270.叶料*料 补骨脂基质加标 LCMSMS 氟虫腈类的出峰情况 氟虫腈 氟甲腈 氟虫腈砜 氟虫腈亚砜 8实验讨论 我们实验室曾用药典推荐的四种前处理方法，无论怎么调整填料的比例，都无法解决补骨脂的基质效应问题，因此我们借鉴了固相萃取3的上样和洗脱方式，发现把 HLB填料量增加一倍以后，反而比传统固相萃取3做出的数据还要好，而且不需要用到大量的甲苯溶剂，对人员和环境都比较友好。通过以上实验数据比对，可以看出，增加填料后的 SelectCore HLB-C 500mg/6mL 中药农残专用固相萃取柱，针对补骨脂中大量色素、挥发油和树脂类成分去除效果良好，且溶液颜色较浅，减少污染气相色谱柱、衬管和离子源的风险，还极大的消除了由于基质效效带来的α-硫丹、苯线磷、甲基对硫磷、对硫磷、三氯杀螨醇等农残成分的拖尾、丢峰、目标物线性不好，回收率差的问题。另外 SelectCore HLB 500mg/6mL 农残专用固相萃取柱，对补骨脂中树脂、挥发油类成分祛除效果良好，减轻了由于基质中干扰物导致的 LCMSMS 上样品中目标化合物响应低和苯线磷砜丢峰的问题，极大地减小了对离子源的污染，且目标化合物回收率高而稳定。两款固相萃取柱结合使用可为补骨脂的农药残留实验数据的稳定性和可靠性提供良好的帮助。 纳谱分析NanoChrom纳谱分析技术(苏洲)有限公司Phone： E-mail： customerservice@nanochrom.com Web： www.nanochrom.com 农残成分回收率农残成分回收率农残成分回收率甲胺磷76.8%地虫硫磷83.9%涕灭威砜103.5%甲基对硫磷84.5%硫线磷109.5%涕灭威亚砜91.0%对硫磷102.7%蝇毒磷89.5%灭线磷83.1%久效磷102.5%治螟磷83.8%氯唑磷101.1%磷胺109.5%特丁硫磷87.4%水胺硫磷83.6%α-六六六84.1%特丁硫磷砜98.4%α-硫丹88.2%β-六六六83.3%特丁硫磷亚砜88.4%β-硫丹85.0%γ-六六六83.9%甲基硫环磷66.5%硫丹硫酸酯90.6%δ-六六六83.3%甲磺隆88.2%氟虫腈91.8%2,4'-滴滴涕76.6%氯磺隆73.5%氟虫腈砜86.7%4,4'-滴滴滴83.7%胺苯磺隆71.4%氟虫腈亚砜98.5%4,4'-滴滴涕79.2%甲拌磷81.3%氟甲腈100.8%4,4'-滴滴伊75.3%甲拌磷砜86.8%o,p'-三氯杀螨醇77.2%杀虫脒80.9%甲拌磷亚砜88.9%p,p'-三氯杀螨醇80.2%除草醚86.6%甲基异柳磷91.7%硫环磷88.5%艾氏剂77.3%内吸磷85.5%狄氏剂76.5%苯线磷70.5%克百威91.7%苯线磷砜100.9%3-羟基克百威78.3%苯线磷亚砜82.3%涕灭威87.1%