中药吴茱萸中33种农残检测方案

HLB-C 净化 (TIC 图) 高挥发油与高生物碱类中药吴茱萸的33种农残测定分析 背景 吴茱萸为芸香科植物吴茱萸、石虎或疏毛吴茱萸的干燥近成熟果实，含有大量的挥发油、柠檬苦素类和生物碱类成分，这些成分对 GCMSMS 和 LCMSMS 分析中个别农残化合物干扰大且响应较低，农残线性和回收率较差，偶见丢峰。常规的固相萃取法一、固相萃取法二、固相萃取法三都不能很好的净化。纳谱分析近期针对以上含挥发油和生物碱样品分析存在的问题，在改进填料的吸附能力的同时，推出了一种组合前处理方法。相比常规固相萃取方式，优化后的三种固相萃取柱可以有所针对性的吸附更多色素、挥发油、生物碱、树脂类成分，从而降低了样品中色素对色谱柱的污染和生物碱、挥发油类照成目标物响应低、保留时间漂移、丢峰等基质效应，有效的提高了吴茱萸样品分析时农残目标物的响应值。今天，我们来看看吴茱萸项目的前处理效果吧。 吴茱萸 适用范围 本方法参考中国药典2020版2341第五法中的固相萃取法2，适用于含有挥发油、|、生物碱类基质干扰大和色素较多的中药材农残检测。 实验步骤 对照品溶液的制备 1.1混合对照品配制 精密量取禁用农药混合1mL， 置20mL量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，备用； 1.2气相色谱-串联质谱法分析用内标溶液的制备 取磷酸三苯酯对照品适量，精密称定，加乙腈溶解并制成每 1mL含1.0mg的溶液，即得。精密量取适量，加乙腈制成每 1mL 含0.1ug的溶液。 1.3空白基质溶液的制备 取空白基质样品，同供试品溶液的制备方法处理制成空白基质溶液。 1.4基质混合对照溶液的制备 分别精密量取空白基质溶液 1.0mL(6份)，置氮吹仪上，40℃水浴浓缩至约0.6mL， 分别加入混合对照品溶液10uL、20uL、50uL、100pL、150uL、200pL，加乙腈稀释至lmL，涡旋混匀，即得。 2 供试品溶液的制备 2.1提取 精密称取5g样品(3号筛)，加氯化钠1g，加入 50mL 乙腈，，：匀浆处理2分钟，离心后分取上清液，残渣再加 50mL乙腈，匀浆处理1分钟，离心后，合并两次提取上清液，减压浓缩至3~5mL，加乙腈定容至10mL，摇匀，置-20℃冷藏 3h 或家用冰箱冷藏过夜，取出趁冷离心 1min(4000 转/min)，分取所有上清液置离心管中，摇匀，待净化。 3 净化 GCMSMS 样品： SPE 柱： SelectCore HLB-C 固相萃取柱 500mg/6mL 净化：取SelectCore HLB-C 固相萃取柱 500mg/6mL 小柱，加乙腈 5mL活化，再取吴茱萸提取液 2mL置已活化的 SelectCore HLB-C 固相萃取柱中，收集样品液，待所有样品液进入柱体填料后，取5mL乙腈洗脱，合并样品液与洗脱液，氮吹至2mL 即得。 GC/MS/MS测定：精密量取过固相萃取柱氮吹定容后的溶液1mL，氮吹至 0.4mL 加入混合对照溶液，乙腈定容至1mL， 再加入0.3 mL 磷酸三苯酯溶液，混匀，过 0.22pm尼龙针式过滤器，上机分析。 注意事项：样品洗脱定容后只有2mL，故需要配置6个浓度点标准曲线时可合并5次分别5根 SelectCoreHLB-C固相萃取柱 500mg/6mL 小柱净化的样品液与洗脱液，40℃以下减压回收至 5mL， 转移至10mL容量瓶，再取适量乙腈冲洗减压回收瓶并入样品液，定容至10mL。如若做快速样品筛查时可直接将净化的样品液与洗脱液并入10mL 已校准的刻度具塞试管中氮吹至 2mL 即得。 LCMSMS样品： SPE 柱： SelectCore HLB 固相萃取柱 500mg/6mL 净化：量取上述吴茱萸提取液 3mL，过 SelectCore HLB 固相萃取柱 500mg/6mL， 收集全部净化液，混匀，即得。 LC/MS/MS测定：精密量取过固相萃取柱后溶液1mL氮吹至0.4mL加入混合对照品液，乙腈定容至1mL，再加入0.3mL水，混匀，过 0.22 um 尼龙针式过滤器，，上机分析。 补充净化办法： (用于吴茱萸 LCMSMS 中3-羟基克百威、特丁硫磷砜、甲拌磷砜)也可用于除甲胺磷、 磺隆类、久效磷以外的化合物联合分析 取： SelectCore GCB/NH2-A 固相萃取柱，加乙腈： 甲苯(3：1)5mL活化，再取吴茱萸提取液2mL 置已活化的 SelectCore GCB/NH2-A 固相萃取柱中，用乙腈：甲苯(3：1)15mL洗脱，收集样品液与洗脱液，减压回收至2mL即得。 注意事项：由于 SelectCore GCB/NH2-A 固相萃取柱净化洗脱液中含甲苯，减压回收时应尽量浓缩干一点，减少甲苯残留，甲苯残留量高可能导致个别化合物保留时间提前，配制样品液与基质加标和前加标液时应不加水， 由于甲苯与水不溶，可能会导致分层而使分析结果不准确。 4 气相色谱-串联质谱法(岛津 GC-MS-TQ8040 NX) 色谱条件 色谱柱： SHIMADZU SH-Rxi-17Sil MS， 30mx0.25mm， 0.25um； 进样口温度：250℃； 升温程序：初始温度为60℃，保持1min； 以10℃/min 升温至160℃；再以2℃/min 升温至230℃，最后以15C/min 升温至 300℃，保持 6min； 载气：高纯氦气(纯度>99.999%)； 进样方式：不分流进样； 恒压模式：146kPa： 进样量：：11uL。 质谱条件 电离方式：电子轰击电离源(EI)； 电离能量：70Ev： 接口温度：2250C： 离子源温度：250℃； 监测方式：多反应检测模式(MRM)； 溶剂延迟：10.0min。 GCMSMS 监测目标物注意事项： 甲基对硫磷定量离子：263.10>109.00 CE：13 参考离子：125.00>47.00CCE：10 地虫硫磷定量离子：245.90>137.00)CCE：5 参考离子：245.90>109.00 CE：15 保留时间(参考)：16-19min与y-666保留时间接近。 久效磷参考 LCMSMS 分析结果。 经过 SelectCore HLB-C 处理后的吴茱萸样品， GCMSMS 分析化合物均无干扰，且氟虫腈类化合物保留时间均无漂移。 5 高效液相色谱-串联质谱法(岛津 LC-MS 8045) 色谱条件 色谱柱： ChromCore C18-MS Pesticides 中药农残专用柱(2.1×100 mm， 2.6 um) 流动相： A： 0.1%甲酸水溶液(含有 5mmol/L 甲酸铵) B：乙乙-0.1%甲酸水溶液(含有5mmol/L 甲酸铵)=95：5 流速：0.3 mL/min 柱温：40℃ 进样量：2uL 梯度： 时间(min) 流速(mL/min) 流动相A(%) 流动相B(%) 0 0.3 70 30 1 0.3 70 30 12 0.3 0 100 14 0.3 0 100 14.1 0.3 70 30 16 0.3 70 30 质谱条件 离子源：电喷雾离子源 (Electrospray ionization， ESI) 正离子扫描 监测方式：多反应监测 (Multiple Reaction Monitoring， MRM) 离子源接口电压：4.5kV 雾化气：氮气3.0L/min 加热气：干燥空气10.0L/min DL 温度：250℃ 加热模块温度：400℃ 接口温度：300℃ 干燥气： N2 10L/min LCMSMS 监测目标物注意事项： 吴茱萸基质中3-羟基克百威和甲拌磷砜响应较低，在样品出现阳性或线性达不到要求时采用上述补充净化办法来联合分析，补充净化办法净化的吴茱萸基质中3-羟基克百威和甲拌磷砜响应较为良好。 目标物 定量离子 CE电压 参考离子 CE 电压 msec 保留时间(参考) 水胺硫磷 291.00>231.00 -15 291.00>121.00 -30 5 5.106 3-羟基克百威定量离子为：238.1>163.1 挥发油基质样品自动进样器托盘温度不宜过低，否则个别样品会出现分层，导致分析结果不准确，建议25℃为宜。 地虫硫磷参考 GCMSMS 分析结果 LCMSMS 可不分析此化合物 甲基异柳磷参考 GCMSMS 分析结果 蝇毒磷参考 GCMSMS分析结果 杀虫脒参考 GCMSMS 分析结果 由于吴茱萸基质复杂，且目标物在吴茱萸基质中干扰情况为基质减弱，响应低，为提高仪器灵敏度，建议LCMSMS样品分析时采用分段采集的办法，分段采集设置时间段为各目标物保留时间前后 0.5min 即可。 表1吴茱萸中33种农药残留的的测定添加回收结果(%) 农残成分 回收率 农残成分 回收率 农残成分 回收率 甲胺磷 79.8% 地虫硫磷 95.7% 涕灭威砜 82.1% 甲基对硫磷 92.9% 硫线磷 83.4% 涕灭威亚砜 94.6% 对硫磷 95.7% 蝇毒磷 85.6% 灭线磷 93.9% 久效磷 79.8% 治螟磷 97.9% 氯唑磷 88.8% 磷胺 92.3% 特丁硫磷 96.7% 水胺硫磷 98.9% α-六六六 92.8% 特丁硫磷砜 100.3% α-硫丹 94.8% β-六六六 91.0% 特丁硫磷亚砜 86.3% β-硫丹 85.0% y-六六六 91.1% 甲基硫环磷 79.0% 硫丹硫酸酯 76.2% 8-六六六 79.3% 甲磺隆 66.1% 氟虫腈 81.9% 2，4'-滴滴涕 91.5% 氯磺隆 61.2% 氟虫腈砜 95.2% 4，4'-滴滴滴 89.2% 胺苯磺隆 63.2% 氟虫腈亚砜 99.0% 4，4'-滴滴涕 89.3% 甲拌磷 97.0% 氟甲腈 97.6% 4，4'-滴滴伊 91.0% 甲拌磷砜 88.3% o，p'-三氯杀螨醇 93.5% 杀虫脒 103.4% 甲拌磷亚砜 86.4% p，p'-三氯杀螨醇 90.2% 除草醚 97.2% 甲基异柳磷 100.6% 硫环磷 85.0% 艾氏剂 94.2% 内吸磷0内吸磷S 101.3%108.8% 狄氏剂 86.1% 苯线磷 81.5% 克百威 77.8% 苯线磷砜 94.6% 3-羟基克百威 65.2% 苯线磷亚砜 89.2% 涕灭威 85.8% 6处理后溶液的颜色比对 GCMS/MS样品： 从左至右分别是吴茱萸提取液、吴茱萸提取液过 SelectCore HLB 500mg/6mL 小柱、吴茱萸提取液过 SelectCore GCB/NH2-A 500mg/500mg/6mL小柱、吴茱萸提取液过 SelectCore HLB-C 500mg/6mL 小柱 7.吴茱萸普通固2柱与 HLB-C柱净化的 CGMSMS数据分析图 杀虫脒(左边为固2净化样品，右边为 HLB-C 净化样品) 8-六六六(左边为固2净化样品，右边为 HLB-C 净化样品) 久效磷(左边为固2净化样品，右边为 HLB-C净化样品) PP-三氯杀螨醇(左边为固2净化样品，右边为 HLB-C 净净样品) 苯线磷(左边为固2净化样品，右边为 HLB-C 净化样品) 水胺硫磷(左边为固2净化样品，右边为 HLB-C净化样品) 吴茱萸普通固2柱与 GCB/NH2-A柱净化的 LCMSMS 数据分析图 甲拌磷砜(左边为常规 HLB 净化样品，右边为 GCB/NH2-A净化样品) 3-羟基克百威(左边为常规HLB 净化样品，右边为 GCB/NH2-A净化样品 特丁硫磷砜(左边为常规 HLB 净化样品，右边为 GCB/NH2-A净化样品 8实验讨论 通过以上实验对比数据可以看出， SelectCore HLB-C 500mg/6mL 小柱净化后的吴茱萸样品溶液颜色较浅，减少了污染 GCMSMS 柱前端的风险， 且GCMSMS 上样品中所有化合物均无干扰，蝇毒磷响应提高了6倍、硫丹硫酸酯响应提高了8倍、8-六六六响应提高了5倍、苯线磷响应提高了5倍。SelectCore HLB500mg/6mL固相萃取柱对吴茱萸中挥发油类成分祛除效果良好，减轻了由于基质中干扰物导致的 LCMSMS上样品中部分目标物响应低的问题。SelectCore GCB/NH2-A 500mg/500mg/6mL解决了3-羟基克百威和甲拌磷砜响应低，丢峰的问题，3-羟基克百威响应提高了10倍。这三款农残专用固相萃取柱，针对吴茱萸中大量色素、挥发油和生物碱类成分去除效果良好，极大的消除了由于基质效应带来的甲基异柳磷、α-硫丹、硫丹硫酸酯、8-六六六、蝇毒磷、氟虫腈类农残成分的响应低、目标物线性不好、保留时间漂移、回收率差的问题，为吴茱萸的农药残留实验数据的稳定性和可靠性提供了良好的帮助。 法类 别 SelectCore QuEChERS 净化 管 15mL. 改良后的配方可以吸附 Q-15A0Pesticide Residue 木香、厚朴、羌活等含挥发油和色素类 更多的色素和挥发油基 6 A06(含色素挥发 质 油中药农残Q法)； 50/pkg 推荐产品 货号 适用品种 注意事项 SelectCore QuEChERS 净化 管 15mL. Q-15A0 丹参专用 改良后的配方提高了丹参农残测定的稳定性和 Pesticide Residue 7 重现性 A07(丹参中药农 残Q法)； 50/pkg SelectCore 适用于含有较多有机酸固 基质简单，色素较少如：人参、西洋参、茯苓、 QuEChERS 净化 Q-15PC 和糖干扰的样品，对磺隆相 白芍、山药、隔山撬、浙贝母、麦冬、葛根、管 04 类和杀虫脒化合物吸附 萃 粉葛、川赤芍、赤芍、白附片、川木通、桑白 15mL. 1200mg 纳谱分析 NanoChrom 三 黄连、黄柏、何首乌、干益母草、吴茱萸、虎 杖、大黄、决明子、胡黄连、苕叶细辛、菊花、 SelectCore千里光、蒲公英、艾叶、荆芥、茵陈、金银花、 适用于干扰较为严重的GCB/NH2-A固相 GNA10番泻叶、龙胆草、蛇床子、川乌、草乌、车前 GCMSMS 样品分析。如萃取柱 0-06100子、地耳草、金钱草、薄荷、广藿香、老鹳草、 若用于LCMSMS样品分500mg/500mg/6m 0-1紫苏叶、忍冬藤、栀子、连翘、莲子心、竹叶 析，应联合其他净化方式 L；30/pkg 柴胡、矮地茶、红景天、麻黄、白鲜皮、赶黄 草、款冬花等 纳谱分析NanoChrom纳谱分析技术(苏州)有限公司Phone： E-mail： customerservice@nanochrom.com Web： www.nanochrom.com 农残成分回收率农残成分回收率农残成分回收率甲胺磷79.8%地虫硫磷95.7%涕灭威砜82.1%甲基对硫磷92.9%硫线磷83.4%涕灭威亚砜94.6%对硫磷95.7%蝇毒磷85.6%灭线磷93.9%久效磷79.8%治螟磷97.9%氯唑磷88.8%磷胺92.3%特丁硫磷96.7%水胺硫磷98.9%α-六六六92.8%特丁硫磷砜100.3%α-硫丹94.8%β-六六六91.0%特丁硫磷亚砜86.3%β-硫丹85.0%γ-六六六91.1%甲基硫环磷79.0%硫丹硫酸酯76.2%δ-六六六79.3%甲磺隆66.1%氟虫腈81.9%2,4'-滴滴涕91.5%氯磺隆61.2%氟虫腈砜95.2%4,4'-滴滴滴89.2%胺苯磺隆63.2%氟虫腈亚砜99.0%4,4'-滴滴涕89.3%甲拌磷97.0%氟甲腈97.6%4,4'-滴滴伊91.0%甲拌磷砜88.3%o,p'-三氯杀螨醇93.5%杀虫脒103.4%甲拌磷亚砜86.4%p,p'-三氯杀螨醇90.2%除草醚97.2%甲基异柳磷100.6%硫环磷85.0%艾氏剂94.2%内吸磷O101.3%狄氏剂86.1%内吸磷S108.8%苯线磷81.5%克百威77.8%苯线磷砜94.6%3-羟基克百威65.2%苯线磷亚砜89.2%涕灭威85.8%