茶叶中茶多酚、咖啡碱、茶氨酸检测方案(液质联用仪)

SSL-CA20-622Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-569 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD. - Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cnTel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn 超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用法同时测定茶叶中茶多酚、咖啡碱及茶氨酸含量 LCMSMS-569 摘要：本应用建立了茶叶中茶多酚、咖啡碱及茶氨酸含量测定定方法。在优化后的色谱及质谱条件下，采用正、负离子模式同时扫描，通过多反应监测(MRM)模式对目标化合物进行测定。结果表明：8种组分在相应的浓度范围内线性良好，所得校准曲线相关系数在0.996以上，各校准点准确度在85.52%~107.87% 之间，所有组分保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在 0.06%~0.25%和1.05%~6.56%之间，加标回收率在73.37~101.6%之间。 关键词：茶叶茶多酚 咖啡碱 茶氨酸 超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用法 茶叶内含物质丰富，主要的营养成分是茶多酚、咖啡碱、茶氨酸及脂多糖等。尤以茶多酚的含量最高，约18%~36%，而茶多酚的主要成分是儿茶素类，占总量的70%以上，茶多酚是茶叶中具有生物活性的重要成分，它不仅是良好的天然抗氧化剂，也是影响茶叶苦涩味的主要成分之一。茶叶鲜味主要取决于茶叶中的游离氨基酸，茶叶中游离氨基酸总量为1%~2%，其中茶氨酸占游离氨基酸总量的50%以上，茶氨酸具有镇静、降血压、提高记忆力和增强人体免疫力的作用。此外，茶叶中含有多种嘌呤碱，其中主要成分是咖啡碱， 含量约2%~5%，咖啡碱属兴奋剂，在一定浓度范围内，对人体有强心、利尿、解毒等生理和保健作用。 本文采用岛津三重四极杆液质联用仪建立了儿茶素(C)、表儿茶素(EC)、没食子酸 (GA)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、茶氨酸(L-The)和咖啡碱(CAF) 同时测定的方法，本方法灵敏度高、重现性好，适用于茶叶中茶多酚、咖啡碱及茶氨酸的快速检测。 1.1仪器 岛津LCMS-8050三重四极杆液质联用系统。配置信息如下： 系统控制器：SCL-40自动进样器：SIL-40C X3柱温箱：CTO-40C输液泵：LC-40BX3脱气机： DGU-405工作站： Labsolutions Ver. 5.99 1.2分析条件 1.2.1液相条件 色谱柱： Shim-pack GIST C18(100mm×2.1mml.D.， 2.0 um； P/N： 227-30001-04， SGLC) 流速：0.3mL/min 进样量：2uL 柱温：35℃ 流动相：A相-水(含0.05%甲酸)，B相-甲醇(含0.05%甲酸) ( 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为30%，洗脱程序见表1 ) 表1 梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 0.30 Pumps B.Conc 30 2.80 Pumps B.Conc 80 3.90 Pumps B.Conc 80 4.00 Pumps B.Conc 30 6.50 Controller Stop 1.2.2质谱条件 分析仪器： LCMS-8050 接口温度：300℃ 离子源： ESI(+/-) DL温度：200C 雾化气流速： 3.0 L/min 加热模块温度：400℃ 干燥气流速：10.0L/min 扫描模式：多反应监测 (MRM) 加热气流速：10.0L/min MRM参数：见表2 表2 MRM 参数 名称 离子模式 前体离子 产物离子 Q1Pre Bias (V) CE(V) Q3 Pre Bias (V) C + 291.2 139.1* -16 -19 -24 123.1 -20 -22 -50 EC 十 291.2 139.2* -20 -16 -28 123.1 -20 -27 -20 EGC 307.0 139.2* -22 -19 -24 163.0 -22 -23 -28 ECG 443.0 139.1* -34 -29 -50 123.1 -22 -23 -22 EGCG + 459.1 139.1* -14 -25 -24 151.1 -14 -16 -28 CAF + 194.9 138.2* -14 -35 -24 110.1 -14 -35 -18 L-The + 174.9 84.1* -12 -40 -32 130.2 -12 -30 -22 GA 169.0 125.1* 20 17 14 79.0 20 23 30 注：*表示定量离子对 1.3混合标准溶液的制备 精密称取 C、EC、EGC、ECG、EGCG、CAF、L-The 和 GA各10mg， 加入50%甲醇-水溶液10mL， 配成浓度均为1 mg/mL的储备液，分别取适量1 mg/mL的储备液混合，然后采用30%甲醇-水(含0.1%甲酸)逐级稀释，配制成不同浓度标准系列溶液(见表3)。 表3 混合标准溶液中各组分浓度 (ng/mL) 目标物 Conc.1 Conc.2 Conc.3 Conc.4 Conc.5 Conc.6 Conc.7 Conc.8 C 2 4 8 16 40 80 160 400 EC 10 20 40 80 200 400 800 2000 EGC 9 18 36 72 180 360 720 1800 ECG 10 20 40 80 200 400 800 2000 EGCG 25 50 100 200 500 1000 2000 5000 CAF 25 50 100 200 500 1000 2000 5000 L-The 10 20 40 80 200 400 800 2000 GA 25 50 100 200 500 1000 2000 5000 样品前处理 称取0.2 g样品于15mL的离心管中，加入70%甲醇-水溶液(70℃水浴锅中事先预热5 min) 5 mL， 摇匀，立即移入70℃水浴锅中，浸提10 min， 冷却至室温，转入离心机中，3500 r/min 条件下离心 10 min， 取上清液转移于 10 mL的容量瓶中，残渣重复以上操作。合并以上提取液用70%甲醇-水溶液定容，摇匀，取提取液10 uL， 采用30%甲醇-水(含0.1%甲酸)定容至3mL，混匀，进样分析。 结果与讨论 3.1 MRM 色谱图 图1 标准溶液定量下限 MRM 色谱图 3.2标准曲线及线性范围 将含有8种组分的混合标准溶液，按1.2中的分析条件进行测定，使用外标法定量。以定量离子峰面积为纵坐标，对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，如图2所示。所得校准曲线相关系数均大于0.996，准确度在85.52-107.87%之间，线性方程及相关系数见表4。 图2标准曲线 表4 线性关系及相关系数 目标物 标准曲线 相关系数R 线性范围(ng/mL) 准确度% C Y=11416.520X-3527.091 0.9997 2~400 97.96~102.93 EC Y=7111.496X+9618.787 0.9960 10~2000 85.52~107.87 EGC Y=11658.600X-17869.650 0.9997 9~1800 95.74~102.16 ECG Y=3908.467X-5202.585 0.9995 10~2000 94.93~102.16 EGCG Y=5619.650X-21883.860 0.9997 25~5000 95.40~102.11 CAF Y=1621.082X-6187.240 0.9970 25~5000 88.08~106.58 L-The Y=3120.187X+2215.765 0.9997 10~2000 96.39~102.38 GA Y=2581.701X+2554.005 0.9993 25~5000 93.00~103.26 3.3检出限及定量限 采用浓度为 2 ng/mL 的混合标准溶液进样，考察检出限和定量限。 Labsolutions 软件依据信噪比自动计算检出限((S/N=3)及定量限 (S/N=10)。。检出限及定量限结果见表5。 表5检出限及定量限结果 目标物 检出限(ng/mL) 定量限(ng/mL) C 0.12 0.40 EC 0.20 0.67 EGC 0.10 0.33 ECG 0.12 0.40 EGCG 0.04 0.13 CAF 0.20 0.67 L-The 0.40 1.33 GA 0.75 2.50 3.4精密度结果 采用定量下限的混合标准溶液连续测定6次，考察仪器的精密度，保留时间和峰面积的重复性。结果如表6所示，8种组分保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在0.06%~0.25%和1.05%~6.56%之间，显示仪器精密度良好。 表6保留时间和峰面积重复性结果(n=6) 目标物 理论浓度(ng/mL) 保留时间 (RSD%) 峰面积(RSD%) C 2 0.25 5.67 EC 10 0.06 4.67 EGC 9 0.17 1.05 ECG 10 0.09 2.30 EGCG 25 0.09 2.95 CAF 25 0.08 6.56 L-The 10 0.18 2.66 GA 25 0.14 1.97 3.5加标回收率 分别精密称取已知8种组分含量的市售普洱茶茶茶样品6份，每份0.2g，再加入一定量的茶多酚、咖啡碱及茶氨酸对照品储备液，按照“样品前处理”方法处理后制备供试品溶液，上机分析，按以下方式考察回收率。 其中： C实测为实际测试浓度 C样品为样品浓度 C添加为添加浓度 添加浓度及加标回收率具体结果如表7所示，结果显示：8种组分的加标回收率在73.37~101.6%之间。 表7 加标回收率结果 目标物 添加浓度(mg/kg) 平均回收率：( (%) RSD(%) C 300 89.95 2.41 EC 1050 73.37 2.75 EGC 450 101.6 1.03 ECG 450 101.2 3.73 EGCG 450 99.31 3.95 CAF 27000 80.52 1.84 L-The 150 99.31 6.31 GA 1200 100.7 2.59 3.6样品测定结果 分别取市售绿茶、红茶和普洱茶样品各0.2g，每批次6样品，按照“2.样品前处理”方法处理及：“1.2分析条件”进行测定，绿茶、红茶和普洱茶样品中不同组分的含量测定结果回算值见表8。 表8 样品测定结果(mg/kg) 目标物 绿茶 红茶 普洱茶 平均值 RSD% 平均值 RSD% 平均值 RSD% C 1046 0.70 62.42 4.84 319.9 1.69 EC 7864 0.53 299.1 1.40 1016 0.81 EGC 22466 0.41 182.1 1.85 560.9 1.66 ECG 20358 0.88 2659 0.46 536.5 1.38 EGCG 63356 0.40 1339 0.74 479.7 0.76 CAF 28948 0.59 35281 0.54 24482 0.76 L-The 11446 1.17 5078 1.16 152.5 7.18 GA 674.4 1.34 2861 2.00 1105 2.14 结论 本应用建立了采用岛津三重四极杆液质联用仪 LCMS-8050 测定茶叶中茶多酚、咖啡碱及茶氨酸的方法，采用岛津 Shim-pack GIST C18 色谱柱进行分离，正、负离子模式同时进行扫描，扫描速度快。本方法分析时间短、回收率高、重复性好，可为茶叶中营养物质的测定提供参考。 岛津应用云  本应用建立了采用岛津三重四极杆液质联用仪LCMS-8050测定茶叶中茶多酚、咖啡碱及茶氨酸的方法，采用岛津Shim-pack GIST C18色谱柱进行分离，正、负离子模式同时进行扫描，扫描速度快。本方法分析时间短、回收率高、重复性好，可为茶叶中营养物质的测定提供参考。