木二糖中杂质检测方案(液相色谱仪)

华谱科仪(北京)科技有限公司 Acchrom·Tech华谱科仪(北京)科技有限公司 华谱科仪(北京)科技有限公司 木二糖高效液相色谱检测方法 木二糖高效液相色谱检测方法 前言 低聚木糖(xylo-oligosaccharide)作为一种附加值高、市场前景好的功能性食品添加剂，是目前国内外竞相研究开发的功能性低聚糖之一。一般认为，低聚木糖是由木二糖~木十糖等组成的，其中以木二糖、木三糖为主要有效成分。在自然界中，竹笋等天然植物中含有少量的低聚木糖；另外，一部分植物半纤维素在人体大肠内也可以被分解转化为低聚木糖。因其独特的生理学特性，现被广泛应用于食品、药品、农业等领域。木二糖是低聚木糖的主要成分，但是木二糖的国家标准尚属空白，急需一种稳定可靠的检测方法对木二糖含量进行分析检测。液相色谱分析法，具有分析速度快，灵敏度高，操作简单的特点，普适性广，利于推广。随着高效液相色谱技术的日趋成熟和普及，高相液相色谱法必将成为木二糖含量测定的主要方法。 图1木二糖结构式 通过检索文献和标准资料发现，目前还原糖柱前衍生大多采用两种方法：1)1-苯基-3- 华谱科仪 甲基-5-吡唑啉酮 (PMP)柱前衍生；2)2-氨基苯甲酰胺(2-AB)柱前衍生。 PMP 在碱性条件下可与木二糖还原端发生衍生反应，生成稳定的、在250 nm下有强紫外吸收的产物。木二糖经 PMP衍生后，可直接采用亲水或反相色谱柱搭配紫外检测器进行分析。衍生反应原理如2所示： 图2木二糖与 PMP 衍生反应原理 木二糖还原羟基端在酸性条件下可被 2-AB 荧光基团取代，使得木二糖带有苯胺衍生物荧光基团，可采用荧光检测器或紫外检测器进行分析。衍生反应原理如图3所示。 图3木二糖与2-AB衍生反应原理 O 实验部分 样品的PMP 法衍生步骤 标准品的配制：精密称取木二糖标准品 10 mg 至10mL容量瓶中，加水溶解并定容，混匀，制成1.0 mg/mL 的木二糖标准储备溶液；用纯水将1.0 mg/mL 木二糖标准储备溶液逐级稀释后摇匀，制成标准曲线系列溶液。 样品的配制：精密称取实际样品 10 mg 至10mL容量瓶中，加水溶解并定容，混匀(可根据实际情况用水稀释)。 衍生：吸取不同浓度标准品溶液或样品溶液 400 uL， 加入 0.5 mol/L 的 PMP 甲醇溶液与 0.3 mol/L 的氢氧化钠溶液各 400 uL，混匀，70℃水浴反应 100 min。加入 0.3 mol/L 的盐酸溶液500pL，用三氯甲烷洗涤3次，每次2mL，弃去三氯甲烷层，水层离心，上清液过 0.45 um 微孔膜待测。 样品的 2-AB 法衍生步骤 标准品的配制：精密称密木二糖标准品 10 mg 至10 mL容量瓶中，加水溶解并定容，混匀，制成木二糖标准储备溶液；用纯水将木二糖标准储备溶液逐级稀释后摇匀，制成标准曲线系列溶液。 样品的配配：精密称取实际样品10 mg 至 10 mL 容量瓶中，加水溶解并定容，混匀(可根据实际情况用水稀释)。 衍生化试剂的配制：称取 45 mg 2-AB， 62.5 mg NaCNBH3，溶解于1mL HAc-DMSO(30：70， v/v)中(2-AB 和 NaCNBH3终浓度分别为0.35 M 和1.0M)，混匀。 衍生：吸取不同浓度标准品溶液或样品溶液 50 pL， 加入 150 pL衍生化试剂，混匀；60oC 水浴反应2 h。衍生结束后离心取上清液用90%乙腈水溶液稀释合适倍数，过0.22um微孔膜待测。 结果与讨论 PMP 法衍生-反相色谱-紫外检测器 用上述 PMP 衍生方法测定木二糖标准品衍生物，结果如图4所示。结果表明，木二糖与其他杂质峰分离度好，保留时间稳定。 图4不同浓度木二糖标准品色谱图对比 采用上述样品前处理方法对实际样品中的木二糖进行测定，包括液体样品和粉末末品，测定结果如图5所示。实际样品中木二糖与其他杂质实现了基线分离，检测结果稳定，不受基质干扰。 图5实际样品中木二糖测定结果色谱图 (XOS-70为液体样品，XOS-85、XOS-60为粉末样品) 2-AB法衍生-亲水作用色谱-荧光检测器 用上述2-AB衍生方法测定木二糖标准品衍生物，搭配荧光检测器进样分析，结果如图6所示。结果表明，木二糖与其他杂质峰分离度好，保留时间稳定，峰形较好。 图6不同浓度木二糖标准品衍生物荧光色谱图对比 采用上述样品前处理方法对实际样品中木二糖含量进行测定，包括液体样品和粉末样品，测定结果如图7所示。实际样品中木二糖与其他杂质实现了基线分离，检测结果稳定，不受基质干扰。 图7实际样品中木二糖测定结果色谱图 (XOS-70 为液体样品， XOS-85 为粉末样品) 2-AB 法衍生-亲水作用色谱-紫外检测器 用上述2-AB 衍生方法对木二糖标准品进行衍生，同时对其他还原性寡糖进行衍生，使用紫外检测器进行检测，结果如图8所示。结果表明，木二糖与杂质峰及其他还原性寡糖均可达到基线分离。 图8木二糖与不同还原性寡糖色谱图对比 采用上述样品前处理方法对实际样品进行前处理，并对样品中木二糖含量进行测定，包括液体样品和粉末样品，测定结果如图9所示。实际样品中的木二糖与其他杂质实现了基线分离，检测结果稳定，不受基质干扰。 图9实际样品中木二糖测定结果色谱图 (XOS-85 为粉状样品， XOS-70 为液体样品) 线性、检测限、定量限 实验针对三种实验方案分别进行了线性、检测限及定量限的考察，具体结果见表1。取7个木二糖标准储备液配制成的不同浓度的标准溶液，以木二糖峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线， PMP 法在 0.002~1.0 mg/mL 内线性相关系数为0.9992， 2-AB衍生-荧光检测法在 0.002~2.0 ug/mL 内线性相关系数为0.9999， 2-AB衍生-紫外检测法在 5~200ug/mL 内线性相关系数为 0.9998。以 S/N=3 为检测限， S/N=10为定量限，测定木二糖的检测限和定量限，检测限最低能够达到 0.4 ng/mL， 定量限最低能够达到1.0 ng/mL， 满足了低浓度定量检测需求。 表1木二糖三种检测方案的线性、检测限和定量限 名称 线性范围 R2 检测限 定量限 PMP衍生-紫外检测器 0.002~1mg/mL 0.9992 0.5 pg/mL 1ug/mL 2-AB衍生-荧光检测器 0.002~2 pg/mL 0.9999 0.4ng/mL 1 ng/mL 2-AB衍生-紫外检测器 5~200 pg/mL 0.9998 2 ug/mL 5 ug/mL 加标回收率 取粉末样品(XOS-85)，添加3种不同浓度的木二糖标准溶液，每个浓度水平平行3 份，按照上述样品前处理方法进行处理，分别测定回收率并计算精密度，具体结果见表2。结果表明各方法回收率均在91%~115%范围内，方法的相对标准偏差(RSD) 为0.93%~8.3%。 表2回收率测定结果表 方法 加标量(mg/mL) 平均回收率(%) RSD(%) PMP衍生-紫外检则器 0.1 95 2.74 0.05 95 2.69 0.01 91 0.93 0.1 115 2.1 2-AB衍生-荧光检测器 0.05 103 5.0 0.01 102 8.3 0.1 97 3.9 2-AB衍生-紫外检测器 0.05 95 4.9 0.01 101 7.5 结论 本文在现有检测糖类物质方法的基础上，开发出木二糖的高效液相色谱分析方法，填补了国内木二色谱分析的空白。与传统糖类物质分析相比，上述三种检测方案具有较高的灵敏度和重复性，且分离性能优越，稳定性良好，适用于多种样品基质体系。衍生方法简单快捷，检测结果稳定重复，搭配不同类型色谱柱与检测器能够实现不同范围的定量检测需求。 联系我们 关注我们 www.acchrom-tech.com 华谱科仪(北京)科技有限公司 热线电话：010-8410-9313 邮箱：marketing@acchrom-tech.com 木二糖与其他杂质峰分离度好，保留时间稳定，不受基质干扰；PMP 法在 0.002~1.0 mg/mL 内线性相关系数为 0.9992，2-AB 衍生- 荧光检测法在 0.002~2.0 μg/mL 内线性相关系数为 0.9999，2-AB 衍生-紫外检测法在 5~200μg/mL 内线性相关系数为 0.9998。以 S/N=3 为检测限，S/N=10 为定量限，测定木二糖的检测限和定量限，检测限为 0.4 ng/mL，定量限为 1.0 ng/mL，满足了低浓度定量检测需求。