植物油中黄曲霉毒素检测方案(液相色谱仪)

华谱科仪(北京)科技有限公司 华谱科仪(北京)科技有限公司 华谱科仪 S6000 液相色谱仪测定植物油中的黄曲霉毒素B族和G族 方案优势 1) 减少前处理步骤，提高实验效率 2) 淋洗液简单 3) 取消氮吹步骤，减少样品损耗，提高回收率 4) 检测时间短，节约时间成本 项目背景 黄曲霉毒素存在于土壤、动植物、各种坚果中，特别是容易被污染的花生、玉米、稻米、大豆、小麦等粮油产品，是霉菌毒素中毒性最大、对人类健康危害极为突出的一类真菌毒素。目前黄曲霉毒素B族和G族的检测的国家现行标准为 GB 5009.22-2016，覆盖了婴幼儿食品、油脂及其至制品、谷物及其制品和调味品等多种食品，实现了黄曲霉毒素B族和G族的检测。其中，黄曲霉毒素B1 和 G1本来具有较强的荧光性，但接触水以后，发生荧光的淬灭现象，荧光性基本消失，很难用液相色谱检测出来，所以我们必须采用衍生的方法使黄曲霉毒素B1 和G1 的荧光性增强，才能满足国际和国内各项检测标准的要求。目前衍生的方法主要有三氟乙酸衍生法、碘衍生法和光化学衍生法等。其中，光化学衍生法是唯一不需要任何化学试剂，直接连接光化学衍生器于色谱柱与荧光检测器之间的方法，操作简单，检测结果准确，灵敏度高。本项目通过柱后光化学衍生方式，开发一种液相方法，可实现植物油中黄曲霉毒素B族和G 族的检测。 实验部分 样品前处理 称取试样5 g于50 mL 的离心管中，加入20 mL 乙腈-水溶液(84+16)或甲醇-水溶液(70+30)，涡旋混匀，置于涡旋振荡器中振荡3 min， 在6000 r/min 下离心10 min，取上清液备用；准确移取 4mL上述上清液，加入36mL的水，混匀，将低温下保存的免疫亲和柱恢复至室温；免疫亲和柱内的液体放弃后，将上述样液移至40 mL 注射器筒中，调节下滴速度，控制样液以1 mL/min ~3 mL/min 的速度稳定下滴，待样液滴完后，往注射器筒内加入10 mL的水，以稳定流速淋洗免疫亲和柱。待水滴完后，用真空泵抽干亲和柱。脱离真空系统，在亲和柱下部放置 10 mL刻度试管，取下40mL 的注射器筒，2×0.5 mL 甲醇+2×0.5 mL 水洗脱亲和柱，控制1 mL/min~3 mL/min 的速度下滴，再用真空泵抽干亲和柱， 收集全部洗脱液至试管中。涡旋混合， 0.22 um 滤膜过滤，收集滤液于进样瓶中以备进样。 仪器配置与分析方法 液相条件 仪器配置 Acchrom S6000 组织器 S6110 四元泵 S6210进样器S6310柱温箱 S6440 荧光检测器 柱后光衍生器 色谱柱 Tnature C18， 4.6 mm*250 mm， 5pm 流动相 A： 甲醇；B：乙腈； C 水 流速 0.8ml/min 进样量 50 pL 柱温 40°℃ 检测波长 激发波长：360nm，检测波长：440mn 结果与讨论 实际样品的测定 图1为植物油样品通过免疫亲和柱前处理后在上述条件下的分离结果，本实验考察植物油基质干扰问题。由图中结果显示，植物油样品基质不干扰黄曲霉毒素出峰，实际样品中黄曲霉毒素未检出。 图1黄曲霉毒素标准品与植物油样品色谱图 线性、检测限、定量限 实验针对黄曲霉毒素进行了线性、检测限及定量限的考察，具体结果见表1。取各组分浓度相同的黄曲霉毒素混标溶液制成不同浓度的混合标准溶液，以待测物峰面积为纵坐标，待测物浓度为横坐标绘制标准曲线，各组分在0.05~40 ng/mL 内线性相关系数为 0.9999。以S/N=3为检测限， S/N=10为定量限，测定黄曲霉毒素的检测限和定量限，由表1结论可知，黄曲霉毒素各峰检测限和定量限均符合国标要求。 表1黄曲霉毒素的线性、检测限和定量限 名称 浓度 R2 方法检测限 方法定量限 国标检测限 国标定量限 G2 0.05-40 ng/ml R2=0.9999 0.01 ug/kg 0.03 pg/kg 0.01 ug/kg 0.03 ug/kg G1 0.05-40ng/ml R2=0.9999 0.03 ug/kg 0.1 ug/kg 0.03 ug/kg 0.1 ug/kg B2 0.05-40 ng/ml R2=0.9999 0.005 ug/kg 0.015 ug/kg 0.01ug/kg 0.03 ug/kg B1 0.05-40 ng/ml R2=0.9999 0.015 pg/kg 0.05 pg/kg 0.03 ug/kg 0.1 ug/kg 加标回收率 通过加标回收实验来验证方法准确度，加标回收率如表2所示。结果表明黄曲霉毒素各峰均有良好的回收率， RSD%符合国标要求。 表2：加标回收结果数据表(n=6，单点外标法) 名称 加标量 (ppb) 回收率 RSD(%) 0.1 106.4% 4.41 G2 1 109.4% 2.54 10 104.1% 1.79 0.1 119.4% 9.38 G1 1 109.0% 2.41 10 99.8% 1.61 0.1 111.9% 5.54 B2 1 107.9% 2.64 10 103.1% 1.77 0.1 117.0% 10.58 B1 108.0% 3.20 10 99.6% 1.77 结论 植物油中黄曲霉毒素的检测在粮油行业中是行业热点，也是重点，其中，黄曲霉毒素B1和 G1 本来具有较强的荧光性，但接触水以后，发生荧光的淬灭现象，荧光性基本消失，很难用液相色谱检测出来，因此检测过程中采用光化学衍生器进行衍生，然后进行检测，本项目优化方法检测限度、线性及加标回收均符合国标要求，并且前处理方法对比国标进行了优化，因此本项目应用方案满足植物油中黄曲霉毒素的检测要求。 植物油样品基质不干扰黄曲霉毒素出峰，实际样品中黄曲霉毒素未检出。黄曲霉毒素各组分在0.05~40 ng/mL内线性相关系数为0.9999。以S/N=3为检测限，S/N=10为定量限，测定黄曲霉毒素各峰检测限和定量限均符合国标要求。