奶粉中核苷酸检测方案(液相色谱仪)

华谱科仪(北京)科技有限公司 Acchrom·Tech华谱科仪华谱科仪(北京)科技有限公司 华谱科仪(北京)科技有限公司 华谱科仪 S6000 液相色谱仪测定食品中的核苷酸 方案优势 1) 优化了国标方法，解决了复杂基质的干扰和峰漂移问题 2) 前处理遵循国标方法，操作简单，无需固相萃取，直接上样 3) 方案灵敏度优于国标要求 4) 分析时间短，分析效率高 5)方法适用性及重现性好 项目背景 核苷酸具有增强血液循环和改善大脑机能的作用，可加快新陈代谢、抗疲劳、抗辐射，尤其可提高婴幼儿抵抗力和免疫力，维护婴幼儿肠道健康，助其健康成长。核苷酸多用于配方奶粉及米粉、益生元等婴幼儿辅食中，因此对婴幼儿配方食品中核苷酸成分的检测越来越重视，需求量也日益增加。 国标 GB 5413.40—2016《婴幼儿食品和乳品中核苷酸的测定》为核苷酸的检测提供了参考依据，但从现行国标描述中发现 CMP 保留时间较短，出峰附近受复杂基质干扰严重，如图1所示。同时实验发现，在检测特医食品中的核苷酸时，确实存在上述问题，且由于基质影响，各核苷酸色谱峰均会出现不同程度的漂移，如色谱图2所示。 图1国标中核苷酸对照品及供试品色谱图 图2验证国标条件核苷酸对照品及供试品色谱图 因此为解决以上问题，基于核苷酸结构特性分析，核苷酸含有单磷酸基团，极性较大，如图3所示。国标方法中采用离子对试剂来增强反相中的保留。但离子对试剂本身就是不稳定因素，，且会对色谱柱造成不可逆的伤害。因此尝试直接在色谱柱固定相表面修饰正电荷，利用反相加离子交换的作用力以增加 CMP 的保留，减少基质对 CMP 的干扰。基于以上思路，本公司开发出 Alphasil XD-C18CH色谱柱。该色谱柱在核苷酸的分析测试中得到了良好的效果，解决了以上问题。 图3五种核苷酸结构式 实验部分 样品前处理 称取样品奶粉5g(精确到0.1mg) 于100mL三角瓶中，加入20 mL 热水(50℃~60℃)充分溶解试样，冷却至室温，或称取混合均匀的液体试样约 20g(精确至 1mg)于100mL锥形瓶中。用醋酸溶液调试样溶液 pH=4.1， 移入50mL容量瓶中，3%H2O2溶液定容，9000r/min 离心 10 min， 上清液用 0.45um 微膜过滤备用。 仪器配置与分析方法 液相条件 仪器配置 Acchrom S6000 组织器 S6110四元泵 S6210进样器 S6310 柱温箱 S6410 紫外检测器 色谱柱 Alphasil XD-C18CH 4.6*150mm 5um 流动相 A：磷酸盐缓冲液；B甲醇 流速 1.0ml/min 进样量 10pL 柱温 20℃ 检测波长 254nm 结果与讨论 实际样品的测定 用上述方法测定 CMP、AMP、UMP、GMP、IMP标准品，结果如图4所示。结果表明，五种核苷酸在 Alphasil XD-C18CH 色谱柱上能得较好的分离，且仅用11 min 就能完成一针的分析。 图4五种核苷酸标准品测定结果色谱图 采用上述样品前处理方法对实际样品中的核苷酸进行测定，选用某品牌配方奶粉，测定结果如图5所示。实际样品中的各核苷酸均实现了基线分离，并且测定结果表明不受基质杂质干扰。 图5某品牌配方奶粉中五种核苷酸测定结果色谱图 表1某品牌配方奶粉中五种核苷酸含量 核苷酸 某品牌样品1 某品牌样品2 CMP 211.45 mg/kg 102.04mg/kg AMP 53.51mg/kg 85.50mg/kg UMP 117.89mg/kg 119.06mg/kg GMP 2.39mg/kg 20.96mg/kg IMP 48.76mg/kg 线性、检测限、定量限 对 CMP、AMP、UMP、GMP、IMP 进行了线性、检测限及定量限的考察，具体结果见表2。取五种标准溶液配制成不同浓度的混合标准溶液，以待测物峰面积为纵坐标，待测物浓度为横坐标绘制标准曲线， CMP 在1~20pg/mL内线性相关系数为 0.9994， AMP在1~20ug/mL 内线性相关系数为 0.9998， UMP 在 1~20ug/mL 内线性相关系数为 0.9997，GMP 在 0.5~10ug/mL 内线性相关系数为 0.9995， IMP在 0.5~10ug/mL 内线性相关系数为0.9993。以 S/N=3为检测限， S/N=10为定量限，测定5种核苷酸的检出限和定量限，均低于国家标准中液相法测定乳品中核苷酸的检出限和定量限，满足了低浓度定量检测需求，具体结果见表2 表2 CMP、AMP、UMP、GMP、IMP 的线性、检出限和定量限 名称 浓度 R2 方法检出限 mg/kg 方法(国标)定量限mg/kg CMP 1~20pg/ml R2=0.9994 0.17 0.52(3.3) AMP 1~20pg/ml R2=0.9998 0.06 0.18 (5.0) UMP 1~20ug/ml R2=0.9997 0.17 0.58 (5.0) GMP 0.5~10pg/ml R2=0.9995 0.13 0.40 (5.0) IMP 0.5~10ug/ml R2=0.9993 0.15 0.46(6.7) 重复性 以标准对照品色谱图考察方法重复性，连续进6针，具体见图6，各核苷酸保留时间RSD%及峰面积RSD%满足要求，结果表明该方法在连续进样时重复性良好。 图6(CMP、AMP、UMP、GMP、IMP对照混标重复性色谱图 加标回收率 取某品牌奶粉样品，添加20、50、100 mg/kg 3 个浓度的核苷酸混合标准溶液， 每个浓度水平平行3组，按照上述样品前处理方法进行处理，分别测定回收率并计算精密度，具体结果见表3。结果表明各核苷酸的回收率均在90%~110%，，方法的相对标准变差(RSD) 为1.5%~7.5%。 表3回收率测定结果表 核苷酸 加标量20mg/kg回收率(%) RSD 加标量 50mg/kg回收率(%) RSD 加标量100mg/kg回收率(%) RSD CMP 104.85 3.16 98.06 1.90 97.42 1.51 97.05 101.56 100.39 100.75 97.22 99.2 AMP 93.8 7.00 102.02 3.29 103.82 6.62 99.75 101.06 103.46 110.95 94.66 92.2 UMP 104.05 5.24 107.52 2.57 105 6.51 106.45 100.96 92.64 94.15 104.00 96.1 GMP 106.05 3.19 109.12 5.96 97.46 3.47 100.15 95.54 100.46 108 97.47 104.44 IMP 100.15 3.98 104.32 2.33 105.16 7.21 108.5 103.30 104.03 99.55 98.83 92.09 结论 本文在现有国标处理方法的基础上优化了检测乳品中核苷酸的分析方法，并进一步优化了核苷酸的前处理方法，解决了复杂基质中 CMP 出峰附近杂峰干扰严重和核苷酸色谱峰漂移问题，方法验证表明该方法灵敏度高，通用性强，无复杂基质干扰，简化了其他标准前处理过程中复杂的 SPE 净化过程，同时实现特医食品及婴幼儿配方奶粉中五种核苷酸在 11min 内的良好分离。该方法是分析乳制品基质中核苷酸的快速有效手段。 联系我们 关注我们 www.acchrom-tech.com 华谱科仪(北京)科技有限公司 热线电话：010-8410-9313 邮箱：marketing@acchrom-tech.com 实际样品中的各核苷酸均实现了基线分离，并且测定结果表明不受基质杂质干扰，且仅用11 min就能完成一针的分析。CMP在1~20μg/ml内线性相关系数为0.9994，AMP在1~20μg/ml内线性相关系数为0.9998，UMP在1~20μg/ml内线性相关系数为0.9997，GMP在0.5~10μg/ml内线性相关系数为0.9995，IMP在0.5~10μg/ml内线性相关系数为0.9993。