中药中黄曲霉毒素检测方案(液相色谱仪)

依据2020版《中国药典》通则2351使用 Agilent 1260 Infinity l1液相色谱和柱后光化学衍生法测定中药中的黄曲霉毒素 肖尧，李功恒 本文依据2020年版《中国药典》四部2351通则， 采用 Agilent 1260Ⅱ液相色谱系统，开发出一种通过柱后光化学衍生分析中药中的黄曲霉毒素的方法，对方法检测限(LOD)、定量限(LOQ)、重现性和回收率等进行考察，并对远志及桃仁样品进行了检测。相比于2351通则中规定的柱后碘化学衍生法，所开发的光化学衍生法成本低廉、操作简单，更适合快速、有效地测定中药材及相关产品中的黄曲霉毒素。 前言 黄曲霉毒素是一种由真菌产生的致癌物质。中药材的生产、加工、贮藏和运输过程复杂，耗时长，加之部分药材具有含油脂多、含糖量大等特性，使得中药材很容易发生霉变而产生黄曲霉毒素"。自然界中自然产生的黄曲霉毒素至少有14种2，常见的黄曲霉毒素主要包括 B1、B2、G1和G2， 其中毒性最强的是黄曲霉毒素B1。2020年版《中国药典》较2015年版对于黄曲霉毒素的控制更加严格，增加了6种需要进行黄曲霉毒素检测的品种，总计达到25个品种。 《中国药典》2020版通则23513中规定的黄曲霉毒素测定法包括液相色谱-荧光检测法、液相色谱-质谱联用法和酶联免疫吸附法。其中，为防止黄曲霉毒素B1和G1发生荧光淬灭，采用液相色谱-荧光检测时需要先进行衍生处理，常见的衍生方法包括柱后碘化学衍生、柱后电化学(溴)衍生、柱前三氟乙酸衍生、柱后光化学衍生等，每种方法都有各自的优缺点。2020版《中国药典》中收载了柱后碘化学衍生法和柱后光化学衍生法。由于柱后碘衍生需要配制专门的衍生试剂并使用相对昂贵的衍生设备，因此考虑到购买成本和操作简易性，对于大多数质量控制部门而言，柱后光化学衍生-液相色谱-荧光检测法最为合适。 本应用简报遵循《中国药典》2020版通则2351， 采用 Agilent1260 Infinity ll四元泵液相色谱系统开发出一种灵敏快速的柱后光化学衍生-荧光检测方法，用于分析黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2。对该方法的检测限(LOD)、定量限(LOQ)、重现性和回收率等进行考察，并对一些实际中药样品进行了分析，结果表明所开发的方法在定量限和检测限方面完全满足现行药典的要求。 试剂和样品 溶剂 甲醇、乙乙(HPLC级)购于迪马公司；超纯水由美国 Millipore 公司 MilliQ 超纯水制备系统制备。 标准品 黄曲霉毒素标准溶液(B1、B2、G1和 G2混标，溶于乙腈中；其中B1和G1 浓度为 1.0 mg/L， B2 和 G2浓度为 0.3 mg/L) 购于上海安谱实验科技股份有限公司。 样品 样品由安捷伦合作客户实验室提供，并依照《中国药典》2020版通则2351中对应方法进行前处理。 仪器和设备 采用 Agilent Infinity 1260 Ⅱ 液相色谱系统，该系统配备如下安捷伦模块：四元泵(部件号 G7111B)、自动进样器(部件号 G7129C)、多功能柱温箱(配置 Large ID 预热器，部件号G7116A)、荧光检测器(8pL流通池，部件号 G7121A)、柱后光化学衍生器(忠测ZW-01，高流速配置，购于成都忠测科技有限公司)。 色谱柱选用 Agilent Pursuit XRs C18 (4.6×250 mm， 5pm， 部件号A6000250X046)。 标准品配制 精确量取0.5mL 黄曲霉毒素混合标准品(黄曲霉毒素B1、B2、G1和 G2标示浓度分别为1.0、0.3、1.0和0.3 pg/mL)，置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为储备液。精确量取1mL储备液，置于25mL 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得到混合对照品溶液，其中黄曲霉毒素 B1、B2、G1和G2浓度分别为2、0.6、2和0.6 ng/mL。 液相色谱条件 结果与讨论 4 种黄曲霉毒素的色谱分离结果 依照《中国药典》2020版通则2351，采用液相色谱-柱后光化学衍生-荧光检测法对标准曲线第3点浓度(进样量15pL)的混合标准品中的四种黄曲霉毒素进行分析，结果如图1所示。从图中可以看出，4种黄曲霉毒素得到良好的分离，分离度 Rs 均大于2，且空白进样中不存在对测定产生影响的干扰物质。表明该方法可用于定量分析四种黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2。 标准曲线与相关系数 按照2020年版《中国药典》要求，分别取黄曲霉毒素混合对照品溶液 5、10、15、20、25pL进样，得到各黄曲霉毒素的标准曲线(见图2)，线性相关系数均大于0.9998。 图1.4种黄曲霉毒素的液相色谱-柱后光化学衍生-荧光检测方法分离结果 峰面积G2， FLD1A 峰面积寸B2，FLD1A 峰面积=16.9162632*含量+2.7831149 峰面积=26.0423509*含量+4.361475 400- 250-相对标准差%(1)：0.260 相对标准差%(1)：9.6853e-2 5 5 350- 200- 图2.4种黄曲霉毒素的线性回归方程和相关系数 采用15 pL的进样量考察方法重现性，连续进样8针，所得各种黄曲霉毒素的保留时间 RSD <0.11%， 且峰面积RSD<0.77%。结果见表1。 表1.4种黄曲霉毒素的保留时间及峰面积重现性 G2 G1 B2 B1 保留时间 RSD (%) 0.04 0.04 0.04 0.11 峰面积RSD (%) 0.76 0.59 0.57 0.77 方法定量限 以 S/N=10计算，按照药典中规定的标准曲线最低点进样并折算方法定量限 (LOQ)进样浓度，结果见表2。将最低浓度的标准曲线溶液进样分析8次，对重现性进行考察，结果见表3。从中可以看出，四种黄曲霉毒素的峰面积 RSD 均小于2%，完全满足准确定量的要求。 表2.4种黄曲霉毒素的方法定量限进样浓度 G2 G1 B2 B1 LOQ (ppb) 0.05 0.17 0.01 0.04 表3.4种黄曲霉毒素在标准曲线最低浓度点的峰面积 RSD值(8次进样) G2 G1 B2 B1 峰面积RSD (%) 1.31 1.99 1.28 1.09 样品分析结果 采用上述分析方法对远志及桃仁样品中的黄曲霉毒素进行测定，所得色谱图见图3。结果表明，样品基质对黄曲霉毒素的分析检测无干扰，且样品中的黄曲霉毒素能够得到灵敏的检出和定量。测得远志样品中黄曲霉毒素 B1 的含量0.033 pg/kg (低于方法要求 LOQ)；桃仁样品中黄曲霉毒素B1的含量 20.75 pg/kg， 黄曲霉毒素B2的含量2.69 ug/kg (由于按照药典方法处理后桃仁样品测定峰面积超出标准曲线的线性范围，因此对样品进行稀释后，再次进样分析并计算结果)。 图3.上图：远志样品；下图：桃仁样品(稀释后进样) 关于方法调整和优化的探讨 由于中药药材的基质比较复杂，即使经过免疫亲和柱净化后，有些样品中的干扰杂质仍然不能完全去除，可能干扰黄曲霉毒素的检出并可能对色谱柱造成污染，出现鬼峰，针对这一问题，我们在满足2020版《中国药典》通则05124液相色谱许可范围内，对方法中流动相中的乙腈比例进行调整，调整后的条件可以极大增强某些基质中干扰杂质与黄曲霉毒素的分离，由于调整范围没有超出0512规定的范围的要求，所以并无需进行任何额外工作。 另外，由于药典中规定使用甲醇溶解样品，在大进样量条件下，可能产生溶剂效应导致峰形变差，针对这个问题，可以使用安捷伦自动进样器的编程进样功能采取“夹心”进样方式解决溶剂效应。 本应用简报开发出一种使用简单的柱后光化学衍生装置与荧光检测器同时测定中药中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的方法。该方法具有良好的线性及重现性，且定量限完全可以满足现行药典中黄曲霉毒素 B1、G1定量限1 ug/kg， B2、G2定量限 0.4 pg/kg的要求。根据实际样品分析结果，该方法可以很好地分离待测成分与基质干扰峰。与碘衍生方法相比，本文所述的光化学衍生法所需的设备操作简单且投资成本低，且避免使用碘衍生方法中难以配制和保存的衍生试剂，大大提升了操作安全性和便利性。 ( 参考文献 ) ( 1 . 胡一晨，万丽，范成杰，吕维，杨芳，吉琅.免疫亲和柱净化 HPLC 柱后光化学衍生化法检测中药及染菌中药制剂中间体的黄曲 霉毒素.中国实验方剂学杂志，2012，18(10)：116-119 ) ( 2. S S ydenham，E.W.，& Shephard， G.S. (1996) in Progress in FoodContaminant Analysis， J. Gilbert (Ed.) ， Chapman and Hall，London， UK， pp 65-146 ) ( 3. 《中国药典》2020版第四部通则2351 ) ( 4. 《中国药典》2020版第四部通则0512 ) ( 5. Vialsamplers Agilent I nfinityLab LC Series User Manual (样品瓶进样器一 Ag i lent InfinityLab 液相色谱系列用户手册).安捷伦用户手册，出版号 G7129-90010，2020 ) www.agilent.com 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 本文中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知。 ( @安捷伦科技(中国)有限公司，2021 ) ( 2021年4月9日，中国出版 ) 5994-3247ZHCN 本文依据 2020 年版《中国药典》四部 2351 通则，采用 Agilent 1260 II 液相色谱系统，开发出一种通过柱后光化学衍生分析中药中的黄曲霉毒素的方法，对方法检测限 (LOD)、定量限 (LOQ)、重现性和回收率等进行考察，并对远志及桃仁样品进行了检测。相比于2351 通则中规定的柱后碘化学衍生法，所开发的光化学衍生法成本低廉、操作简单，更适合快速、有效地测定中药材及相关产品中的黄曲霉毒素。