米粉中米酵菌酸检测方案(液质联用仪)

SSL-CA20-384Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-517 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.-Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cnTel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn 超高效液相色谱-串联质谱法测定米粉中的米酵菌酸 LCMSMS-517 摘要：本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8045 联用测定米粉中米酵菌酸含量的方法。米酵菌酸在优化后的色谱及质谱条件下，采用负离子模式进行电离，通过多反应监测(MRM)模式对目标化合物进行测定。结果表明：使用基质匹配外标法定量，米酵菌酸在 0.1 ng/mL~20ng/mL浓度范围内线性良好，所得校准曲线线性相关系数在0.999以上，各校准点准确度在94.2%~105.5%之间，且精密度和回收率实验结果良好。 米酵菌酸 (Bongkrekic Acid) 是一种由椰毒假单胞菌酵米面亚种产生可引起食物中毒的毒素，是变质淀粉类制品，发酵玉米面制品及变质银耳引起食物中毒的主要原因。该毒素耐热性极强，即使100℃的开水煮沸或用高压锅蒸煮仍不能破坏其毒性，进食后经消化道吸收、经血液散布全身后可损伤人的肝脏、脑、肾及心脏等器官，严重者可致死亡。近年来，在我国已发生多起由米酵菌酸引起的食物中毒事件，其中2018年广广东东莞和河源发生的米粉中毒事件，以及2020年在黑龙江鸡西市发生“酸汤子”食物中毒事件，均已造成多人死亡。 目前，米酵菌酸常用测定的方法有液相色谱法和液相色谱-串联质谱联用法。现行的食品安全国家标准《GB5009.189-2016食品中米酵菌酸的测定》，采用高效液相色谱法测定银耳及其制品、发酵米面及其制品等食品中的米酵菌酸，方法灵敏度低，且前处理有机试剂消耗量大，过程繁琐耗时。液相色谱-串联质谱联用法具有很高的灵敏度和选择性，适合于复杂基体中的痕量物质分析，且准确度高。本文基于岛津超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用技术，建立了米粉中米酵菌酸含量的测定方法。该方法稳定、灵敏度高，适用于米粉中米酵菌酸的快速检测。 1.1仪器 岛津LCMS-8045三重四极杆液质谱联用系统。具体配置为： 系统控制器：CBM-20A脱气机： DGU-20As输液泵： LC-30AD×2自动进样器： SIL-30AC柱温箱： CTO-20A检测器： LCMS-8045 色谱工作站： LabSolutions Ver. 5.96 1.2分析条件 液相条件 色谱柱： Shim-pack GISS C18 (100 mm x 2.1 mm I.D.， 1.9 um， P/N：227-30048-02，岛津(上海))实验器材有限公司) 流动相：A相-5mM乙酸铵+0.1%甲酸水溶液 B相-乙腈 流速：0.3 mL/min 进样体积：5uL 柱温：40℃ 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为40%，时间程序见表1。 表1 梯度洗脱程序 Time Module Command Value 0.50 Pumps Pump B Conc. 40 4.00 Pumps Pump B Conc. 90 5.00 Pumps Pump B Conc. 90 5.10 Pumps Pump B Conc. 40 7.00 Controller Stop 质谱条件 离子源：ESI，负离子模式离子源接口电压：-3.0kV雾化气：氮气3.0L/min干燥气：氮气10 L/min加热气：空气10 L/min 脱溶剂管温度：200℃ 加热模块温度：400℃ 接口温度：300C 扫描模式：多反应监测(MRM) MRM参数：见表2 碰撞气：氩气 驻留时间：150ms 表2 MRM 参数 化合物名称 英文名称 CAS No. 监测离子对 Q1 pre (V) CE Q3 Pre (V) 米酵菌酸 11076-19-0 485.3>441.3* 14 12 28 bongkrekic acid 485.3>397.3 14 20 24 注：*表示定量离子对 1.3样品前处理方法 称取5.00g试样(精确至0.01 g) 置于50mL聚四氟乙烯具塞离心管中，加入15 mL 80%甲醇水溶液(含0.5%甲酸， v/v)。混匀，室温下避光浸泡1h，置于超声波振荡器中超声提取30 min。再以6000 r/min，离心20 min， 取上清液1mL过0.22 um 微孔有机滤膜后进行 LC-MS/MS 分析。 1.4混合标准溶液的配制 取空白试样，按1.3中前处理方法操作后，获得空白基质溶液。取适量1 ug/mL的米酵菌酸的标准中间溶液，使用空白基质溶液进行稀释，配制成浓度为 0.1 ng/mL、0.25 ng/mL、0.5 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL、10ng/mL和20 ng/mL 的基质匹配标准系列工作液，供液相色谱-串联质谱仪测定。以定量离子峰面积为纵坐标，对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。 结果与讨论 2.1标准样品的 MRM 色谱图 图1米酵菌酸标准样品 MRM 图谱 (1ng/mL) 2.2线性范围与检出限 将0.1 ng/mL、0.25ng/mL、0.5 ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10 ng/mL 和20 ng/mL 不同浓度的米酵菌酸基质标准工作液，按1.2中的分析条件进行测定，使用外标法定量。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制校准曲线如图2所示。所得校准曲线线性关系良好，线性方程及相关系数见表3。 图2米酵菌酸的校准曲线 表3 标准曲线与检出限信息 化合物名称 校准曲线 线性范围(ng/mL) 准确度(%) 检出限(ng/mL) 米酵菌酸 Y=14144.59X-162.70 0.9999 0.1~20 94.2~105.5 0.03 2.3精密度实验 对1.0 ng/mL、2.5 ng/mL 和 5.0 ng/mL 不同浓度的米酵菌酸基质标准工作液连续测定6次，考察仪器的精密度，保留时间和峰面积的重复性结果如表4所示。结果显示：不同浓度样品中米酵菌酸保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在0.09%~0.12%和0.57%~3.06%之间，显示仪器精密度良好。 表4保留时间和峰面积重复性结果(n=6) Conc.(ng/mL) RSD% (R.T.) RSD% (Area) 1.0 0.12 3.06 2.5 0.09 2.16 5.0 0.09 0.57 2.4回收率实验 称取空白米粉样品，加入少量米酵菌酸标准溶液，使加标浓度分别为 2 ug/kg， 10 ug/kg 和20 ug/kg。按照1.3样品前处理方法提取净化后，测定米酵菌酸的加标回收率。空白米粉样品 MRM 色谱图如3所示，2 ug/kg 加标样品 MRM 色谱图如4所示，加标回收率结果见表5。由结果可知，该方法灵敏度高，且准确率好。 图3空白米粉样品 MRM 图谱 图4米酵菌酸的加标样品 MRM 图谱 (2 ug/kg) 表5 米酵菌酸的加标回收率结果 (n=3) 名称 加标水平(ug/kg) 平均回收率% 米酵菌酸 2 94.0 10 104.8 20 102.2 结论 本文建立了一种使用岛津超高效液高色谱 LC-30A和三重四极杆质谱仪 LCMS-8045 联用测定米粉中米酵菌酸含量的方法。米酵菌酸在4 min内出峰，且峰形良好。使用基质匹配外标法定量，米酵菌酸在 0.1 ng/mL~20ng/mL浓度范围内线性良好，所得校准曲线线性相关系数在0.999以上，各校准点准确度在94.2%~105.5%之间，且精密度和回收率实验结果良好。方法学结果表明，本方法操作快速，精密度高，回收率好，，1可用于米粉中米酵菌酸的快速测定。 岛津应用云 建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A和三重四极杆质谱仪LCMS-8045联用测定米粉中米酵菌酸含量的方法。米酵菌酸在优化后的色谱及质谱条件下，采用负离子模式进行电离，通过多反应监测(MRM)模式对目标化合物进行测定。结果表明：使用基质匹配外标法定量，米酵菌酸在0.1   ng/mL ~20   ng/mL浓度范围内线性良好，所得校准曲线线性相关系数在0.999以上，各校准点准确度在94.2%~105.5%之间，且精密度和回收率实验结果良好。