妇科止带片\绿袍散中金胺O检测方案(液质联用仪)

SSL-CA20-377Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-511 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.，LTD.-Analytical Applications CenterTel：86(21)34193996Email： sshzyan@shimadzu.com.cnhttp：//www.shimadzu.com.cn 黄柏违规使用金胺O染色剂的定性测定 LCMSMS-511 摘要：本文采用岛津 LC-20ADXR高效液相色谱系统、LCMS-8040 高效液相色谱串联质谱系统，建立了黄柏中金胺○的定性方法。妇科止带片、绿袍散经70%乙醇提取， Shim-pack GIST C18 色谱柱分离， PDA检测，未检出金胺O；绿袍散、妇科止带片加标样品在 RT=16.2 min 和 23.4 min 检出色谱峰(435nm)，经与金胺0光谱图比较，初步识别为金胺O。采用LCMS-8040 对目标峰进行分析， SCAN+触发产物离子模式扫描，目标峰与金胺○针素一级、二级质谱图相似度极高，推测目标峰为金胺O。本文建立了基于液相色谱、、UV光谱以及串联质谱的绿袍散、妇科止带片中染色黄柏的的鉴别方法，该方法选择性强，灵敏度高，有效保障了临床用药安全。 关键词：LC-20ADXR LCMS-8040 黄柏 金胺O妇科止带片 绿袍散 金胺O，也称碱性嫩黄O，是一种合成染色剂，主要用于蚕丝、棉、腈纶、羊毛等的染色。金胺○曾发现被用于劣质黄柏、蒲黄、延胡索等中药材、中药饮片的非法染色。金胺○对人体具有一定毒性作用，被列为非食用物质，在中药材、中药饮片和中成药中均不得检出。 国家药监局此前发布了《绿袍散中金胺○检查项补充检验方法 (BJY 201922)》、《妇科止带片中金胺○检查项补充检验方法 (BJY 201902)》等多项公告， 对涉及黄柏药材的中成药，规定了金胺○染色剂的定性测定方法。采用液相色谱法，以保留时间、PDA光谱图信息对金胺○进行定性识别。 本文参考以上两项补充检验方法，基于液相色谱-二极管阵列检测器-三重四极杆质谱，建立了妇科止带片、绿袍散违规使用染色黄柏的定性测定方法。该方法综合考虑色谱分离、UV光谱以及质谱定性要素，选择性强，灵敏度高，供相关行业参考。 岛津 LCMS-8040 超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用系统，配备 PDA 检测器。具体配置如下 输液泵：LC-20ADXR×2 系统控制器：CBM-20A 自动进样器：SIL-20AC 三重四极杆质谱仪：LCMS-8040 柱温箱：CTO-20AC 色谱工作站：LabSolutions Ver. 5.98 在线脱气机：DGU-20A5R 二极管阵列检测器：SPD-M20A 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱柱： Shim-pack GIST C18 色谱柱(250mm× 4.6mml.D.， 5um)总岛津(上海)实验器材有限公司，P/N 227-30017-08 流动相： A-0.02mol/L乙酸铵水溶液；B-甲醇 流速：1mL/min 柱温：40℃ 进 样 体 积 ： 1 0 u L 波长：435nm 洗脱方式绿袍散：梯度洗脱，梯度见表1，初始10%； 妇科止带片片：等度洗脱，B相浓度为30% 分流比：柱后三通分流，约30%进质谱 表1 梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 5.00 Pumps Pump B Conc. 20 20.00 Pumps Pump B Conc. 70 22.00 Pumps Pump BConc. 10 30.00 Controller Stop 质谱条件 离子源参数 离子源：ESI* 加热模块温度：400℃ 雾化气流速：3.0 L/min 干燥气流速：15.0 L/min DL温度：250℃ 扫描模式： MS SCAN/触发产物离子扫描 MS参数：扫描范围 m/z100-350，触发产物离子，优选离子 m/z 268.2，CE=-25V 1.3对照品溶液配制 精密称取金胺O标准品2.0 mg， 用1.0mL乙醇溶解，并稀释至2 ug/mL工作液，待测。 1.4供试品制备 取绿袍散内容物1.0g，加甲醇50ml， 超声处理20分钟，放冷，滤过，取续滤液，即得； 取妇科止带片(包衣片除去包衣)适量，研细，取2.5 g， 加入70%乙醇10 ml， 密塞，超声处理30分钟，放冷，滤过，取续滤液，即得。 1.5结果判断 供试品色谱中，应不得出现与对照品色谱保留时间相同的色谱峰。若出现保留时间相同的色谱峰，则采用二级管阵列检测器比较相应色谱峰的紫外-可见吸收光谱(220~700nm)，吸收光谱应不相同。必要时采用高效液相色谱-质谱联用方法确证。(源自《绿袍散中金胺○检查项补充检验方法(BJY 201922)》，国家药品监督管理局，2019年11月) 结果与讨论 2.1色谱图 金胺○对照品分别按照梯度和等度条件分析，金胺○保留时间分别为 RT=16.2 min 和23.4 min，理论塔板数103893、8703，均大于2000，系统适应性通过。对照品、供试品、供试品加标进行分析，如下图1，供试品中未检出金胺O，而供试品加标样品可检出金胺O，初步判定绿袍散、妇科止带片中无金胺O，结果符合预期。 绿袍散加标样品 妇科止带片加标样品 图1对照品、供试品、供试品加标色谱图 2.2检出限及定量限 对浓度为 2 ug/mL的金胺○溶液进样分析，由信噪比计算其检出限及定量限(LOD， S/N=3； LOQ，S/N=10)，结果如表1所示。 表1金胺○针素的检出限和定量限 名称 基质 检出限(ug/mL) 定量限(ug/mL) 金胺○ 绿袍散 0.007 0.024 金胺0 妇科止带片 0.059 0.20 2.3光谱图相似度判别 供试品加标样品中金胺○与对照品的保留时间一致，保留时间 RSD<2%。对照品、供试品加标样品对应色谱峰的光谱图见图2，其光谱相似度为分别为97.3%、98.3%(图3)，光谱相似度高，推测为金胺0. 金胺O标品与绿袍散加标光谱图(220-700nm) 金胺○与妇科止带片加标光谱图(320~500nm) 图2供共品、供试品加标样品光谱图 ID# 显示 对象 对象参数 比例 缩放倍车 Amax 入min 相似度 Ch# 时间 16.22097 正常化 1.00 436/202/371/250/315 194/388/325/290/220 Ref 1 2 光谱 绿录加标.jcm 正常化 3.91 436/203/371/252/314 193/388/222/291/327 0.9733 ID# 显示 对象 对象参数 比例 缩放倍车 max 入min 相似度 Ch# 1 时间 23.37477 设置 1.00 437/204/371/250 193/387/220/292/326 Ref 1 2 光谱 妇科加标.jcm 设置 0.30 436/204/372/250 195/389/221/288/325 0.9832 图3光谱相似度对比结果 2.4液相色谱质谱联用方法确证结果 为了进一步进行定性确认，使用 LCMS-8040 对加标样品中目标色谱峰进行分析。在使用液质联用分析时，需进行柱后分流进样，以保证质谱的离子化效率。对照品中金胺○质谱图如下图4，观测到正离子模式[M+H]+峰，m/z 268.20， 对前体离子进行碰撞，碰撞能 CE=-25V，二级质谱图登录 MSn 库。绿袍散加标样品在RT=16.19min 色谱峰检出色谱峰，一级质谱图基峰为 m/z 268.20，二级质谱图进行谱库检索，与金胺○相似度100分(满分100)，主要碎片离子 m/z 252.00、m/z 147.15、 m/z 122.10、m/z 107.20均与金胺O碎片离子一致，如图5所示；妇科止带片加标，二级质谱图匹配得分99分。以上结果表明，三重四极杆质谱用于金胺○定性选择性强，重现性好。 图4 对照品中金金O一级质谱图(MS1)、、二级质谱图 (MS2) 图5加标样品二级质谱图谱库检索结果 结论 本文采用岛津LC-PDA-MS/MS 高效液相色谱串联质谱系统，建立了含黄柏中药材中违使使用金胺○染色的定性确认方法。该方法基于色谱保留时间、UV光谱以及一级、二级质谱图定性，选择性强，准确度高，供相关行业参考。 岛津应用云 本文采用岛津LC-PDA-MS/MS高效液相色谱串联质谱系统，建立了含黄柏中药材中违规使用金胺O染色的定性确认方法。该方法基于色谱保留时间、UV光谱以及一级、二级质谱图定性，选择性强，准确度高，供相关行业参考。