丙氨酸氨基转移酶中催化活性浓度检测方案(紫外分光光度)

使用 Agilent Cary 3500 紫外-可见分光光度计测定丙氨酸氨基转移酶催化活性浓度 作者 前言 李敏 北京航天总医院 张晓丹 安捷伦科技(中国)有限公司 酶催化活性浓度测量是医学参考实验室的基础检测项目。目前，国际检验医学溯源联合委员会 (JCTLM) 已批准由国际临床化学和实验室医学联盟 (IFCC)编写的七种酶(L-丙氨酸氨基转移酶 (ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶 (AST)、乳酸脱氢酶 (LDH)、α-淀粉酶 (AMY)、肌酸激酶(CK)、V-谷氨酰转肽酶 (GGT) 和碱性磷酸酶 (ALP))的参考方法，即《IFCC在37°℃酶催化活性浓度测量的原级参考方法》。 本研究参照《IFCC 在37°℃化催化活性浓度测量的原级参考方法第4部分：丙氨酸氨基转移酶催化浓度测定参考方法》，使用 Agilent Cary 3500 紫外-可见分光光度计对丙氨酸氨基转移酶 (ALT) 的催化活性浓度进行监测。该方法中的基本原理是：在37℃的恒温条件下，L-丙氨酸与2-酮戊二酸在 ALT 的催化下生成丙酮酸和L-谷氨酸，丙酮酸与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NADH) 在乳酸脱氢酶的作用下生成乳酸和 NAD*(如以下反应方程式所示)；然后通过监测339 nm 下 NADH 的氧化速率((即吸光度的下降速率)来测定丙氨酸氨基转移酶的催化活性浓度，，二者呈正比关系。 L-丙氨酸+2-酮戊二酸ALT丙酮酸+L-谷氨酸丙酮酸+NADH+H*LD乳酸+NAD* 本研究采用配备八池四温区控温附件的 Agilent Cary 3500 紫外-可见分光光度计进行测试，仪器的精准控温功能可以保证每个池位中样品的温度均可以满足 IFCC 规定的37.0±0.1℃的控温要求。实验样品采用国家级标准物质 GBW(E)090282a、GBW(E)090283a 以及 IFCC组织的2020年度参考测量实验室外部质量评价计划 (RELA) A、B样本。 基本操作流程如下： 确认测量条件合格(仪器、试剂和环境条件) 2)打开分光光度计及辅助设备 3)监测比色杯内温度达37.0±0.1℃ 4)准备试剂和分析溶液，并孵育反应液试剂达37℃ 5)在比色杯内加入2mL反应液和0.2mL分析溶液，充分混匀 6)孵育5分钟达37℃，加入0.2mL起始反应液，充分混匀，并延迟90s 7)监测吸光度读数180s 在正确度验证实验中，检测国家级标准物质 GBW(E)090282a 和GBW(E)090283a，每份样本检测3次，计算均值，比较其是否在标物的靶值±不确定度范围内；检测 IFCC 组织的2020年 RELA样本A和B，每份样本检测3次，计算均值是否在其等效限内。结果均列于表1中。从中可以看出，所得结果均符合等效限的要求，表明该方法具有良好的正确度。 表1.正确度验证结果 项目 丙氨酸氨基转移酶 (ALT) 靶值(U/L) 测量均值(U/L) 偏移(%) 等效限(U/L) GBW(E)90282a 62.60 63.39 1.26 61.2-64.0 GBW(E)090283a 180.60 182.56 1.09 178.1-183.1 2020RELA-A 196.78 200.01 1.64 186.45-207.11 2020RELA-B 90.82 89.68 -1.26 86.05-95.59 在精密度验证实验中，选择2020RELA-A 和2020RELA-B两个浓度水平的样本作为精密度测量样本，每天检测2批，每批测量3次，连续检测2天，结果见表2。从中可以看出，两种浓度样本的实测浓度总 CV均小于1%，符合实验室对测量精密度的要求。 表 2.2020RELA样本分析精精密度 样本 两天测量均值(U/L) 两天测量SD (%) 两天测量CV(%) 汇总均值(U/L) 汇总SD(%) 汇总CV(%) 2020RELA-A 199.68 1.49 0.74 199.46 1.29 0.64 199.24 1.14 0.57 2020RELA-B 89.31 0.63 0.70 89.71 0.89 0.99 90.12 0.97 1.08 使用配备八池四温区控温附件的 Agilent Cary 3500 紫外-可见分光光度计测定酶催化活性浓度，在人员和试剂等因素稳定的前提下，完全能够满足科研和常规测量工作的要求。与传统的紫外-可见分光光度计配置的水控温/半导体控温附件相比， Cary 3500UV-Vis 八池四温区控温附件在酶催化反应测试领域中具有以下明显优势： 1)温度是酶催化反应过程的重要影响因素。 IFCC 参考方法要求将实验温度控制为37±0.1℃，如果温度控制失败会造成实验结果错误及昂贵样品的浪费。传统多池控温附件很难将所有池位的温度差控制在±0.1℃，所以经常当作单池使用或者挑出温差小的部分池位(2至3个)使用，操作繁琐，实验效率低。 Cary 3500UV-Vis 的八池四温温控温附件，每两个池位由一组控温模块独立控制，相当于同步运行四台单独的控温设备。通过软件参数设置，可将每个池位温度控制在 IFCC 要求的37±0.1℃区间内，同步完成四个样品的测试，对于酶参考实验室进行国际比对工作的高通量样品测试需求具有重要的意义 2)传统的控温附件采用水浴循环的方式控温，噪声大且温度升降的缓冲时间较长，每次实验前需要留出一定的时间(>30 min)等待温度平衡。 Cary 3500 UV-Vis 采用空冷控温，升温速度快，5-10 min 即可实现温度平衡。且无需水浴，避免了实验室噪声以及水浴长菌的困扰，用户体验度更佳 3)与此同时， Cary 3500 UV-Vis 采用氙灯光源，光源寿命为20000小时以上，控温模块采用全新的一体式设计，无任何移动部件。因此仪器无需任何维护，用户维护成本低 ( 参考文 献 ) ( 1. International F ederation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine， Scientific Division， Committee on Reference Systems for Enzymes (C-RSE). I FCC P rimary Reference Procedures f o r the Measurement of Catalytic ActivityConcentrations of Enzymes at 37°℃：Pa r t 4. ReferenceProcedure for the Measurement of Catalytic Concentration of Alanine Aminotransferase ) ( 声明：仅用于科学研究，不可用于临床诊断和治疗。 ) 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 ( 本文中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知。 ) ( @安捷伦科技( 中 国)有限公司，2021 ) ( 5994 - 3010ZHCN ) ·Agilent，中国出版Trusted Answers 本研究参照《IFCC 在 37 °C 酶催化活性浓度测量的原级参考方法第 4 部分：丙氨酸氨基转移酶催化浓度测定参考方法》[1]，使用 Agilent Cary 3500 紫外-可见分光光度计对丙氨酸氨基转移酶 (ALT) 的催化活性浓度进行监测。该方法中的基本原理是：在 37 °C 的恒温条件下，L-丙氨酸与 2-酮戊二酸在 ALT 的催化下生成丙酮酸和 L-谷氨酸，丙酮酸与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NADH) 在乳酸脱氢酶的作用下生成乳酸和 NAD+（如以下反应方程式所示）；然后通过监测 339 nm 下 NADH 的氧化速率（即吸光度的下降速率）来测定丙氨酸氨基转移酶的催化活性浓度，二者呈正比关系。