生物样品中胆汁酸检测方案(液相色谱仪)

使用 Agilent InfinityLab Poroshell 120EC-C18 液相色谱柱通过 HPLC 和ELSD 分析胆汁酸 Rongjie Fu ( Jeffrey Lei ) 使用 Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18色谱柱(2.7 pm 和 4 um 填料粒径) 通过 HPLC 分析结合胆酸和游离胆酸。通过梯度法， InfinityLab Poroshell 120 EC-C18，4.6×250 mm， 4 pm 色谱柱在32分钟内实现了所有胆汁酸的分离。将该方法转移至InfinityLab Poroshell 120 EC-C18， 4.6×100，2.7 pm色谱柱，实现了快速分离，分析时间在13分钟内。 在本应用简报中，采用配备 InfinityLabPoroshell 120 EC-C18，4.6×250 mm，4 um 色谱柱的HPLC 分离表1中列出的14种胆汁酸和胆固醇。为了实现快速分离，将该方法转移至较短的 InfinityLabPoroshell 120 EC-C18，4.6×100 mm，2.7 um 色谱柱。由于游离胆酸缺少特征发色团，因此采用 ELSD 以获得足够高的灵敏度。 试剂与化学品 所有试剂均为 HPLC 及或更高等级。HPLC级甲醇和乙腈购自J.T. Baker(Center Valley， PA， USA)。 水经由 ELGAPURELAB Chorus 系统 (High Wycombe，UK) 纯化。乙酸铵购自北京百灵威科技有限公司。标准品购自Sigma-Aldrich(St. Louis， MO， USA)。标准储备液均采用甲醇配制，浓度为 1 mg/mL。将所有单标溶液混合至各自浓度约为 70 ug/mL，制得混标溶液。 仪器与材料 ( 色谱柱入口： Agilent InfinityLabQuick Connect 快速连接液相色谱接头(部件号5067-5965) ) ( 色谱柱出口：Agilent InfinityLab Quick Turn 液相色谱接头 、( (部件号 5067-5966) ) ( Agilent Captiva 经济型过滤器， PT FE 膜， 直径13 mm， 孔径0.2 um (部 件号5190-5265) ) ( 安捷伦样品瓶，螺口盖，棕色，带书写签，经认证，2mL(部件号 5182-0716) ) 安捷伦固定螺口盖，蓝色，带 PTFE/红色硅胶隔垫(部件号5190-7024) 编号 化合物 分子量(g/mol) CAS号 结构 1 甘氨猪去氧胆酸 449.63 13042-33-6 OHOH H H HOH OH 2 牛磺猪去氧胆酸钠 521.69 110026-03-4 H Na+H HO` OH 3 甘氨胆酸 465.62 475-31-0 HO HN O HO OH H 4 牛磺胆酸钠 537.68 145-42-6 S=O Na+ HN- H 含 HO 'OH 5 猪去氧胆酸 392.57 83-49-8 OH HO OH 6 胆酸 408.57 81-25-4 OH H H H HO OH H Agilent InfinityLab 溶剂瓶，棕色，1000mL(部件号9301-6526) 表 1.本应用简报中分离的化合物(续) Agilent InfinityLab Stay Safe 溶剂瓶安全盖， GL45，3口，1个放空阀(部件号5043-1219) Eppendorf 移液管和重复用移液器 超声仪(VWR， Radnor， PA， USA) 仪器 Agilent 1290 Infinity II高速泵(G7120A) Agilent 1290 Infinity II Multisampler(G7167B) Agilent 1290 Infinity II高容量柱温箱(G7116B) Agilent 1290 Infinity II ELSD(G7102A) Agilent OpenLab CDS， C.01.07 版 编号 化合物 分子量(g/mol) CAS号 结构 7 甘氨鹅去氧胆酸钠 471.61 16564-43-5 0 -0 Nat NHO H H HO 'HOH 8 牛磺鹅去氧胆酸钠 521.69 6009-98-9 O O Na+ NH O H H HO 'OH H 9 甘氨脱氧胆酸 449.63 360-65-6 .OH HN OH H H HO 10 牛磺脱氧胆酸钠 521.69 1180-95-6 S Na+OHN- OQH H HO H 11 鹅去氧胆酸 392.57 474-25-9 OH H HO OH 表1.本应用简报中分离的化合物(续) 编号 化合物 分子量(g/mol) CAS号 结构 12 脱氧胆酸 392.57 83-44-3 OH H HO H 13 石胆酸 376.57 434-13-9 OH H H H HO 14 石胆酸甲酯 390.6 1249-75-8 O H HO H 15 胆固醇 386.65 57-88-5 H HO' HPLC条件 色谱柱 InfinityLab Poroshell 120 EC-C18， 4.6×100 mm，2.7pm(部件号695975-902) InfinityLab Poroshell 120 EC-C18，4.6×250mm， 4pm(部件号690970-902) 流动相A 20 mmol/L 乙酸铵水溶液 流动相B 乙腈：甲醇(60：40) 梯度 0-2分钟， B 为 40%2-8分钟， B由40%升至60% 8-10分钟， B为100%停止时间：15分钟 0-5分钟， B为40%5-20分钟，B由40%升至60%20-25分钟，B为100% 停止时间：37分钟 流速 1.50 mL/min 柱温 60℃ 进样量 4pL 10pL ELSD条件 蒸发器温度 80°℃ 雾化器温度 30℃ 气体流速 1.60 SLM 图1中上方色谱图显示了 InfinityLabPoroshell 120， 4.6×250 mm， 4 um色谱柱对15种化合物的分离结果。在32分钟内完成了分析，实现了完全基线分离。将该方法转移至较短的色谱柱，该色谱柱具有2.7 um 的较小的填料粒径。分析时间缩短至仅12.5分钟，但所有化合物 仍获得了出色的分离度。4 um 表面多孔填料颗粒的柱效是传统 5 pm 全多孔填料颗粒的两倍。2.7 pm 表面多孔填料颗粒可提供与亚 2 um 全多孔填料颗粒相媲美的 UHPLC 性能，但反压相对更低。与亚2 um UHPLC 色谱柱常用的 0.5 um 筛板相比， InfinityLab Poroshell 120 EC-C18色谱柱上的2 um 筛板更不容易堵塞。 因此， InfinityLab Poroshell 120 EC-C18色谱柱对于“脏”样品具有更好的耐受性。进行胆汁酸分析的实际样品一般为生物样品，例如胆汁、血清和尿液样品。InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 色谱柱非常适合此类样品的分析。 图1.使用 InfinityLab Poroshell 120 EC-C18， 4.6×250mm， 4 pm 色谱柱和 InfinityLab Poroshell 120 EC-C18， 4.6×100 mm， 2.7 pm 色谱柱得到的胆汁酸分离色谱图 为了实现更好的分离，调整了 HPLC参数，包括流动相组成和柱温。在本次分离中，柱温对于分离十分重要。图2显示了不同柱温下的分离结果。当温度升高时，峰3、4和5的洗脱顺序发生改变，且分离度得到改善。 4 um 和2.7 um 填料粒径色谱柱均可实现所有胆汁酸的良好分离。填料粒径较小的短色谱柱实现了快速分离，显著缩短了分析时间并节省了溶剂。 HPLC 联用 ELSD的优化方法适用于胆汁酸分析。 图2.使用 InfinityLab Poroshell 120 EC-C18，4.6×100 mm， 2.7 um 色谱柱在不同柱温下得到的色谱图 查找当地的安捷伦客户中心：www.agilent.com/chem/contactus-cn www.agilent.com 免费专线：800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 仅限研究使用。不可用于诊断目的。 联系我们： 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 LSCA-China_800@agilent.com ◎安捷伦科技(中国)有限公司，2019 在线询价： ( 2019年3月14日， 中国出版 ) 5994-0807ZHCN www.agilent.com/chem/erfq-cn 使用 Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 色谱柱（2.7 µm 和 4 µm 填料粒径）通过 HPLC 分析结合胆酸和游离胆酸。通过梯度法，InfinityLab Poroshell 120 EC-C18, 4.6 × 250 mm, 4 µm 色谱柱在 32 分钟内实现了所有胆汁酸的分离。将该方法转移至InfinityLab Poroshell 120 EC-C18, 4.6 × 100, 2.7 µm 色谱柱，实现了快速分离，分析时间在 13 分钟内。