新型生物聚合物载药系统（壳聚糖-FITC-OPP 水凝胶微粒）中合成检测方案(紫外分光光度)

仪器 作者 Mohammad Al Kobaisi 博士 Matthew Quinn 博士” ”安捷伦科技有限公司，澳大利亚墨尔本 壳聚糖载药系统的平行合成与表征 使用 Cary 3500 控温紫外-可见分光光度计监测交联机理 稳定、可控的生物兼容性载药系统非常重要，并对药物和疫苗给药系统有显著影响11.2。寻找创新和改进的新方法来制备载药系统，可以避免使用生物兼容性较低的材料，并提供更稳定的载体以及更容易的制备途径3。 壳聚糖是一种存在于甲壳类生物(例如螃蟹和龙虾)壳中的多糖。因具有高度稳定的化学活性、生物兼容性和控释能力而得到广泛研究1，4.5，本研究也选择它作为研究对象。壳聚糖溶于弱酸性水性溶剂，可通过共价或离子交联形成各种尺寸和形状的水凝胶装置。聚磷酸盐常用于制备壳聚糖纳米和微米颗粒。本文中，我们研究了一种新型聚磷酸盐(八磷酸四苯基卟啉(OPP))诱导壳聚糖水凝胶化，它是一种光活性生色分子，可用作壳聚糖交联剂(图1)。壳聚糖与OPP交交，自组装成 OPP生色 团。该机制导致光谱变化，并可使用紫外-可见光谱法来监测这一变化。 阴离子形式的 OPP 膦酸基团(图1)与壳聚糖的质子化胺发生强烈相互作用，使溶液中的聚合物链发生交联。这个过程可形成直径约1 um 的颗粒，能够包埋各种生物活性化合物(例如疫苗抗原或药物)。 图1.具有可用氨基基团的壳聚糖示意图(左图)，以及显示了可用膦酸基团的八磷酸四苯基卟啉 (OPP)的分子结构(右图) 本研究中，我们使用 Agilent Cary 3500 紫外-可见光光光度计对OPP-壳聚糖的交联机理进行了监测与研究。 Cary 3500能够通过软件来控制样品池中的搅拌，并且对环境光不敏感，因此特别适合此项研究。其光不敏感性可实现按顺序添加试剂，而不会影响基于时间的测量数据。通过原位合成，最大程度减少了操作步骤。 壳聚糖-FITC-OPP 水凝胶微粒的制备与监测 本实验使用了异硫氰酸盐荧光素(FITC) 标记的壳聚糖的1%乙酸溶液。按照以下步骤将壳聚糖溶液逐步加入固定体积的OPP 溶液中制备样品： 1.将2 mL 0.125 mg/mL 的OPP (pH值约为7)加入装有星形 PTFE 磁力搅拌子的3.5 mL 石英样品池中 2. 将装有水的样品池放在参比通道中作为对照 3. 然后使用 1 mol/L 盐酸(HCI) 将 OPP 溶液的 pH调至4.5，以匹配壳聚糖溶液的 pH。这确保了交联过程中观察到的变化与 pH 值的变化无关 4. 平衡20秒后进行波长扫描 5. 根据表1少量添加一系列 2% w/v 壳聚糖-FITC。每次添加后平衡20秒，然后进行波长扫描 6. 完成壳聚糖-FITC 添加后，加入1 mol/L 氢氧化钠 (NaOH)使 pH值恢复为7。再次平衡20秒后进行波长扫描 表1.实验过程中对样品进行的添加 实验 序号 壳聚糖体积 (pL) 总体积 (pL) 壳聚糖 (mg/mL) OPP (mg/mL) pH 1 0 1500 0.000 0.125 7.0 2 0 1500 0.000 0.125 4.5 3 20 1520 0.263 0.123 4.5 5 40 1540 0.519 0.122 4.5 6 90 1590 1.132 0.118 4.5 7 140 1640 1.707 0.114 4.5 8 200 1700 2.353 0.110 4.5 9 300 1800 3.333 0.104 4.5 10 500 2000 5.000 0.094 4.5 11 700 2200 6.364 0.085 4.5 12 1000 2500 8.000 0.075 4.5 13 1500 3000 10.000 0.063 4.5 14 4.5 15 5.0 16 5.4 17 6.0 18 6.5 19 1500 3000 10.000 0.063 7 20 1500 1500 20.000 0 4.5 本研究选用 Agilent Cary 3500 双池紫外-可见分光光度计。仪器参数见表2。 表2.紫外-可见分光光度计实验参数 参数 设置 波长范围(nm) 200-1100 光谱带宽(nm) 1 信号采集平均时间(s) 0.1 娄据间隔(nm) 1 搅拌速度(rpm) 500 颗粒制备 在pH值为7和4.5时，分别在417 nm 和441 nm 处观察OPP主峰，监测 OPP交联壳聚糖的制备情况，如图2所示。将 pH 值由7调节至4.5，可避免加入酸性壳聚糖前体溶液后pH值发生变化。由于OPP的吸光度取决于 pH， 因此改变 pH值非常重要。 图2.在使用 OPP 的交联过程中对壳聚糖-FITC 进行波长扫描(350-550nm)。数字标记1-13为实验序号，如表1所示。为了清楚起见，对谱图进行了偏移。425 nm 处的峰表示与交联的壳聚糖-FITC 相关的 OPP 将 pH值调节至4.5后，逐步加入壳聚糖前体。在壳聚糖-FITC浓度达到 0.261% w/w之前，壳聚糖前体的加入对 OPP 417 nm峰几乎没有影响，达到该浓度后在 425 nm 处出现了一个峰。然后逐渐调节溶液 pH， 使其恢复至生理相关 pH 值(pH 7)，即 OPP 起始 pH值。调节至pH7后，产物溶液的光谱在425 nm 处出现一个清晰的峰，而417 nm 处的原始峰消失。425 nm 处的吸光度可归因于仅与交联的壳聚糖-FITC 相关的OPP。交联壳聚糖颗粒的存在也可通过光散射在波长范围内的信号增强(随着波长的减小而增强)来表示。这在较短的波长(瑞利散射)下更加清楚，并可在约300 nm 处轻松观察到，如图3所示。 图3.在使用 OPP 的交联过程中对壳聚糖-FITC 进行波长扫描(200-800 nm)。 数字标记1-13为实验序号，如表1所示。为了清楚起见，对谱图进行了偏移。较短波长处信号的增强表示颗粒散射。655 nm 处的峰为游离 OPP 游离 OPP 在约 655 nm 处产生吸收。通过监测655 nm 峰，可以确定OPP 的消耗情况(参见图3)。这表明该过程表现出滴定行为，可以观察到等当点，并且可以检测反应终点。 不含任何 OPP的聚合物的波长扫描结果证实了光谱峰位移的变化和吸收强度的变化是由于 OPP 生色团的环境变化所致。这些光谱变化可归因于静电环境的变化，以及在交联过程中随着分子的聚集，芳族核间更加加近(图2)。 使用 Cary 3500 双池紫外-可见分光光度计对新型生物聚合物载药系统(壳聚糖-FITC-OPP水凝胶微粒)的合成进行了监测。 Cary 3500具有软件控制的搅拌功能，可直接将溶液添加到样品池中进行合成。通过波长扫描对合成进行持续监测，可以确定纯交联剂的吸收峰何时从417 nm 移至425nm。峰位移表明已发生交联，水凝胶微粒已经形成。 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： ( 参考文献 ) ( 1 . Mohammed， M. A.； Syeda，J.T. M.； Wasan， K. M.； Wasan， E. K. An Overview of Chitosan N anoparticlesand Its Application in Non-Parenteral Drug Delivery.Pharmaceutics， 2017，9(4) ， 53 ) ( 2. B ernkop-Schnurch， A.； Dunnhaupt， S. Chitosan-baseddrug delivery systems. Eur. J.Pharm.Biopharm.， 2 0 12，81 (3)，463 ) ( 3. Hu， L.；Sun， Y.； Wu， Y. Advances in chitosan-based drugdelivery vehicle s ， Nanoscale，2013，5(8)， 3103 ) ( 4. Bhosale， S. V.； Kalyankar， M. B .； Nalage， S. V.； Lalander， C. H.； Bhosale， S. V.； Langford， S. J.； Oliver， R . F. pH dependent molecular self-assembly of octaphosphonate porphyrinof nanoscale dimensions： nanosphere and nanorodaggregates. I nt. J. Mol.Sci.， 2011 ， 12 ( 3)， 1 464 ) ( 5. Giacalone， G . ； Hillaireau， H .；Capiau， P.； Chacun， H.；Reynaud， F.； Fattal，E. Stabilization and cellular delivery ofchitosan-polyphosphate nanoparticles by incorporation of iron. J. Control. Release， 2014， 194， 211 ) LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 ( 5994-1093ZHCN ) 使用 Cary 3500 双池紫外-可见分光光度计对新型生物聚合物载药系统（壳聚糖-FITC-OPP 水凝胶微粒）的合成进行了监测。Cary 3500 具有软件控制的搅拌功能，可直接将溶液添加到样品池中进行合成。通过波长扫描对合成进行持续监测，可以确定纯交联剂的吸收峰何时从 417 nm 移至 425 nm。峰位移表明已发生交联，水凝胶微粒已经形成。