mAb 样品中宿主细胞蛋白 (HCP) 杂质检测方案(液相色谱仪)

应用简报 Agilent制药与生物制药Trusted Answers 采用 Agilent 6495C 三重四极杆 LC/MS系统定量分析宿主细胞蛋白质杂质 Linfeng Wu 安捷伦科技有限公司 本应用简报介绍了 mAb 产品中亚 ppm 宿主细胞蛋白质杂质的定量分析方法。本工作流程采用 Agilent AssayMAP Bravo 平台、Agilent 1290 Infinity ll 液相色谱系统和Agilent 6495C 三重四极杆 LC/MS 系统。 宿主细胞蛋白(HCP)杂质是低浓度的蛋白质杂质，来源于生物药物生产过程中的宿主生物。由于它们可能影响产品安全性和功效，因此根据法规要求必须对药品中的 HCP 进行监测和控制。传统上，酶联免疫吸附测定法 (ELISA) 是定量分析蛋白质治疗药物中 HCP 的标准方法。然而， ELISA 的特异性和覆盖率不足以鉴定并定量分析各种HCP。因此， LC/MS 技术成为 HCP分析的另一选择。在 HCP的LC/MS定量分析过程中，主要挑战在于低丰度 HCP 肽段与高丰度药品肽段的共洗脱。因此需要在药品基质的高背景下对低丰度肽进行灵敏而可重现的定量分析。本应用简报介绍了用于宿主细胞蛋白质高 灵敏度定量分析的完整工作流程解决方 案，包括： 用于样品自动前处理的 AgilentAssayMAP Bravo 平台 用于样品分离的 Agilent 1290 InfinityⅡ液相色谱仪 用于数据采集的 Agilent 6495C 三重四极杆LC/MS系统 用于 MRM 方法开发的 Skyline 软件中的安捷伦自动化工具 使用 Agilent MassHunter 定量分析软件和 Skyline软件进行数据处理 使用基于多反应监测 (MRM)的同位素稀释方法，结果显示可准确定量低至亚 ppm(ng/mg) 浓度的 HCP。 仪器 ( Agilent AssayMAP Bravo 系统 (G5571AA) ) ( Agilent 1290 Infinit y ll 液相色谱系统包括： ) ( · A gilent 1290 Infinit y ll高速泵 (G7120A) ) ( · Agilent 1290 Infinity II Multisampler (G7167B)，配备样品冷却装置选件 (选件100) ) ( · Agilent 1290 InfinityⅡI柱温箱 (G7116B) ) ( Agilent 6495C 三重四极杆 LC/MS系统 ) ( 安捷伦喷射流 ESI离子源 (G1958-65138) ) 材料 人lgG1 mAb (来自合作伙伴的一种研发产品)由中国仓鼠卵巢 (CHO)细胞产生，并经过 Protein A 纯化。重型稳定同位素标记 (SIL)肽标准品由第三方供应商定制合成(表1)。所有SIL 肽经 HPLC纯化，质量通过 LC/MS 和氨基酸分析测定。 表1.液相色谱参数 液相色谱参数 分析柱 表面带电荷的反相 C18色谱柱 流动相A H，0， 0.1%甲酸 流动相B 90%乙腈水溶液，0.1%甲酸 流速 0.5 mL/min 进样量 20 pL 梯度 0min→3% B1 min→3%B 10 min→21%B10.5 min→90%B 12 min→90%B12.5 min→3%B 停止时间 13 min 后运行时间 1 min 柱温 60°℃ 样品前处理 使用 AssayMAP Bravo 系统进行 mAb 样品变性、还原、烷基化和胰蛋白酶解。将 SIL 肽以等摩尔浓度混合，并以8种不同司度(每种 SIL 肽浓度为6.25、12.5、25、62.5、125、250、12500、125000 amol/pg) 加入样品酶解物中，用于定量分析。 LC/MS分析 ( 使用9分钟液相色谱梯度，通过 6495C 三重四极杆 LC/MS 在 dMRM 模式下分 析样品。表1和表2详细列出了色谱和质谱分析的实验条件。使用与 Skyline 和 Agilent MassHunter 工作站软件集成的安 捷伦自动化工具对 LC-dMRM 方法进行自 动优化。 ) 数据处理 ( 使用 Agilent MassHun t er 工作站软件和Skyline 软件进行多肽定量的数据分析。 ) 表 2. Agilent 6495C 三重四极杆 dMRM 方法 参数 设置 离子模式 喷射流，正离子 气体温度 150C 干燥气流速 19 L/min 雾化器气体 35 psi 鞘气温度 250°℃ 鞘气流速 11 L/min 毛细管电压 4000 V 喷嘴电压 OV 高/低压力 RF 电压 200/110V Delta EMV 200 V Q1和Q3分辨率 Unit/Unit 分析周期 500 ms 最小/最大驻留时间 28.85 ms/60.39 ms LC-dMRM 方法开发 为了评估 HCP 分析的定量性能，使用AssayMAP Bravo 自动化系统使纯化的mAb经历变性、还原、烷基化和胰蛋白酶酶解。将该样品酶解物在以下实验中用作 mAb 背景基质。将三种 SIL 标准肽加入样品酶解物中进行标准曲线分析，包括两种与SUM01 和 SYHC 外源蛋白匹配的肽和一种与内源性 HCP (即 CHO 蛋白质S100-A11)匹配的肽(表3)2。所有 SIL肽标准品的纯度大于95%。 使用 MassHunter 和 Skyline 自动化工作流程优化 LC-dMRM 方法(图1)。在此工作流程中，首先在 Skyline 软件中创建目标肽段和离子对。使用自动化工具自动创建和执行 MRM 方法和任务列表，以确定多肽保留时间，优化碰撞能量，分析数据并导出最终 LC/MS 方法3。 mAb 基质中 SIL 肽标准品的定量分析 在 mAb 背景基质中评估定量分析三种SIL 肽标准品的灵敏度性能。空白进样建立系统清洁度后，对所有浓度进行重复进样(n=5)，浓度范围为 6.25 amol/ug 至125 fmol/ug， 每次进样的载样量为8 ug(表4)。所有目标蛋白质的标准曲线范围从低至亚 ppm 到超过 1000 ppm，涵盖了与 HCP 分析相关的较宽范围。确定了所有样品(n=40) 的保留时间(RT)重现性，以及每种浓度的峰面积重现性和定量分析准确度： 图1. Skyline上的安捷伦自动化工具 表3.目标蛋白质、肽和离子对 目标蛋白质 蛋白质来源 目标肽段序列 SIL 肽质量(%) 监测离子对(m/z) SUM01_HUMAN UPS2蛋白质标准品 LLLEYLEEK 98.2 575.3→1036.6575.3→923.5575.3→810.4575.3→681.3579.3→1044.6579.3→931.5579.3→818.4 579.3→689.4 SYHC_HUMAN UPS2蛋白质标准品 VFDVIIR 96.2 431.3→762.5 431.3→615.4431.3→500.4431.3→401.3436.3→772.5436.3→625.4436.3→510.4 436.3→411.3 蛋白质 S100-A11(G3HUU6) CHO细胞 DPGVLDR 95.1 386.2→559.3386.2→502.3386.2→403.2391.2→569.3391.2→512.3 391.2→413.2 ( 所测试的浓度具有出色的线性， LLLEYLEEK的 R²= 0 .9993， V F DVIIR的R2=0.9990， DPGVLDR 的R²= 0.9995(图2A至图4A) ) 所有浓度均表现出出色的精度和准确度，包括定量下限(LLOQ)(表4) ( 全部三种蛋白质在低浓度下具有高灵敏度， L LOQ 低至亚 ppm级(图2B 至图4B和表4， SUMO1_HUMAN 为 0.48 ppm， SYHC_HUMAN 为 0.7 ppm， CHO 蛋白质 S100-A11 为 0.13 ppm) ) SIL 肽 VFDVIIR 和 DPGVLDR 存在一些背景基质干扰。即便如此，目标蛋白质仍获得了亚 ppm的LLOQ (图3B和图4B) ( 所有40次进样均具有出色的 RT 重 现性 ( L LLEYLEEK 的 RSD=0.06%， VFDVIIR 的 RSD=0.08%， DPGVLDR 的RSD =0.47%) ) 本实验所用色谱柱的载样容量大于8ug。因此，如由需要，可柱上进样更高载样量来实现更低的 LLOQ 浓度。 表4. mAb基质中 SIL 肽的精度和准确度。 LLOQ 浓度以红色突出显示 蛋白质名称/分子量 SUM01_HUMAN/38815 Da SYHC_HUMAN/58233 Da 蛋白质S100-A11 (G3HUU6)/11241 Da 肽段序列 LLLEYLEEK VFDVIIR DPGVLDR SIL 肽加标浓度 (amol/pg) %RSD (n=5) %准确度 蛋白质浓度* (ppm) %RSD (n=5) %准确度 蛋白质浓度*(ppm) %RSD(n=5) %准确度 蛋白质浓度*(ppm) 6.25 11.3 144.0 0.24 18.1 160.1 0.35 15.8 137.5 0.07 12.5 14.5 110.2 0.48 3.3 114.8 0.70 8.2 106.2 0.13 25 3.4 98.2 0.95 8.7 92.9 1.40 8.3 103.2 0.27 62.5 1.5 84.2 2.38 3.7 80.5 3.50 5.3 82.9 0.67 125 4.0 80.3 4.77 2.7 80.1 7.00 9.0 87.8 1.34 250 2.2 81.5 9.53 3.1 80.1 14.01 4.9 88.1 2.67 12500 2.3 94.0 476.45 1.2 90.9 700.25 1.2 93.8 133.63 125000 1.9 100.7 4764.54 0.6 101.0 7002.52 0.6 100.7 1336.27 *根据SIL 多肽纯度调整 采集时间 (min) 图2.胰蛋白酶酶解后的 mAb 基质中重型肽标准品 LLLEYLEEK 的定量分析结果。A)标准曲线，附带插图显示低浓度曲线的详细信息。B)显示出 LOD 和 LLOQ 的叠加提取离子色谱图 ×102 图3.胰蛋白酶酶解后的 mAb 基质中重型肽标准品 VFDVIIR的定量分析结果。A)标准曲线，附带插图显示低浓度曲线的详细信息。B)显示出 LOD 和 LLOQ的叠加提取离子色谱图 图4.胰蛋白酶酶解后的 mAb 基质中重型肽标准品 DPGVLDR 的定量分析结果。A)标准曲线，附带插图显示低浓度曲线的详细信息。B)显示出 LOD 和 LLOQ的叠加提取离子色谱图 对蛋白质进行绝对定量分析 生物药物生产过程中需要监测和控制宿主细胞蛋白质杂质浓度。在此过程中，测量目标HCP 的绝对浓度十分重要。只要有合适的参比标样，基于质谱的分析对该应用具有极高的特异性和准确性。由于 SIL标准肽的可用性和成本，与目标蛋白质序列相匹配的 SIL 标准肽被广泛应用于绝对定量分析。 我们对先前HCP 发现工作中鉴定出的内源性 HCP (即 CHO 蛋白质 S100-A11)进行了绝对定量分析。采用两种方法计算绝对蛋白质浓度。在第一种方法中，使用了内源性肽 DPGVLDR 的平均响应和图 4A 中的标准曲线方程确定肽的绝对浓度。在第二种方法中，使用相同 LC/MS运行中的轻型肽和重型肽之间的响应比来确定内源性肽浓度(图5)。与预期结果 相同，这两种方法产生了类似的 CHO 蛋白质 S100-A11的蛋白质浓度(1.05与1.47 ppm)。这些结果进一步证明了： 安捷伦 HCP 发现工作流能够鉴定个位数 ppm 级的 HCP 6495C 三重四极杆 LC/MS 系统是一种可靠的低浓度肽定量分析方法 ( 本文展示了用于 HCP 定量分析的安捷伦工作流程解决方案的性能。采用以任务为 中心的自动化方案的 AssayMAP Bravo 平 台为样品前处理自动化带来了前所未有 的重现性、 可扩展性、灵活性和简便易用性。 Agilent 1290 Infinit y ll 液相色谱仪 是新一代 UHPLC 系统， 具有更出色的色 谱分离度和保留时间精度。 Skyline 软件 和Agilent MassHunter 软件无缝集成， 结合使用自动化工具为优化 LC-dMRM 方法提供了简单的解决方案。使用 Agilent6495C 三重四极杆 LC/MS 系统证明了亚 ppm 级浓度 HCP 的准确定量分析。Skyline 和 MassHunter 软件的结合已证 明是靶向数据分析的强大工具。 ) ( 参考文献 ) ( 1. ICH Q6B Specifications： TestProcedures and Acceptance Criteriafor Biotechnological/Biological Products ) ( 2. 使用 Agilent AssayMAP Bravo 和 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF分析 宿主细胞蛋白质，安捷伦科技公司应 用简报，出版号5991-9300ZHCN， 2018 ) ( Agilent Triple Quadrupole LC/MSPeptide Quantitation with Skyline (利用 Skyline 进行安捷伦三重四极 杆 LC/MS肽定量分析)，安捷伦 科技公司应用简报，出版号5990- 9887EN， 2017 ) 查找当地的安捷伦客户中心：www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价：www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 安捷伦科斗(中国)有限公司，2019 本文展示了用于 HCP 定量分析的安捷伦工作流程解决方案的性能。采用以任务为中心的自动化方案的 AssayMAP Bravo 平台为样品前处理自动化带来了前所未有的重现性、可扩展性、灵活性和简便易用性。Agilent 1290 Infinity II 液相色谱仪是新一代 UHPLC 系统，具有更出色的色谱分离度和保留时间精度。Skyline 软件和 Agilent MassHunter 软件无缝集成，结合使用自动化工具为优化 LC-dMRM 方法提供了简单的解决方案。使用 Agilent 6495C 三重四极杆 LC/MS 系统证明了亚 ppm 级浓度 HCP 的准确定量分析。Skyline 和 MassHunter 软件的结合已证明是靶向数据分析的强大工具。