干血片中溶血磷脂酰胆碱检测方案(液质联用仪)

SSL-CA20-159Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-471 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.-Analytical Applications CenterTel： 86(21)34193996Email： sshzyan@shimadzu.com.cnhttp：//www.shimadzu.com.cn LCMS-8050CL用于罕见病 X-ALD 筛查应用研究 LCMSMS-471 摘要：本文使用岛津临床用液相色谱三重四极杆质谱仪 LCMS-8050 CL 及X-连锁肾上腺脑白质营养不良筛查和诊断试剂盒(液相色谱-串联质谱法，质谱生物科技有限公司)，建立了干血片中4种种血磷脂脂胆胆同时测定的方法，该方法可辅助筛查诊断X-连锁肾上腺脑白质营养不良。使用试剂盒的内标、标准品、质控控及新生儿滤纸干血片进行了方法的准确度及精密度考察，使用岛津 Neonatal 新筛数据处理软件对筛查结果进行数据处理。结果显示该方法准确度及精密度均满足试剂盒要求， Neonatal 新筛数据处理软件可以应用于筛查数据处理。该方法对X-连锁肾上腺脑白质营养不良的临床判断、治疗管理和生理评估具有辅助筛查诊断的意义。 关键词：LCMS-8050 CL罕见病X-ALD 筛查 X-连锁肾上腺脑白质营养不良 (X-linked adreno-leukodystrophy， X-ALD) 是过氧化物酶体功能异常导致的脂代谢异常疾病，属于遗传代谢病。临床主要表现为大脑白质进行性脱髓鞘病变和肾上腺皮质功能不全。该病由X染色体上 (Xq28) ABCD1 (adenosinetriphosphate-binding cassetteD1) 基因突变引起，导致过氧化物酶体功能缺失，长链脂肪酸不能被β氧化，大量极长链脂肪酸 (very long chain fatty， VLCFA) 沉积于大脑白质和肾上腺，导致神经系统功能异常及肾上腺皮质功能减退。95%的患者为男性，而女性多为杂合子，属于疾病基因突变的携带者。男性 X-ALD的发病率为1/21000~1/15500，而男性 X-ALD 和女性杂合子携带者的共同发病率为1/17000。 X-ALD 临床表现多样，典型X-ALD 患者出现中枢神经系统损害和肾上腺皮质功能低下两类症状。通过准确定量患者干血 片中四种溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine，LPC)：二十碳溶血磷脂酰胆碱 (C20：0 LPC)、二十二碳溶血磷脂酰胆碱 (C22：0LPC)、.、二十四碳溶血磷脂酰胆碱 (C24：0LPC) 和二十六碳溶血磷脂酒胆碱(C26：0LPC)，可快速筛查诊断X-ALD， 从而尽早进行饮食控制、类固醇替代、造血干细胞移植等治疗，可预防患儿智力、精神、运动发育落后和肾上腺皮质功能受损。 本文使用岛津临床用液相色谱三重四极杆质谱仪LCMS-8050 CL及X-连锁肾上腺脑白质营养不良筛查和诊断试剂盒(高效液相色谱-串联质谱法，质谱生物科技有限公司)，建立了滤纸干血片中4种溶血磷脂酰胆碱含量测定方法，该方法前处理简便，分析速度快，灵敏度高，专属性强，可供相关人员参考。 实验部分 1.1仪器 本实验使用岛津临床用超高效液相色谱与三重四极杆质谱仪联用系统。具体配置为 LC-30AD CL×2(输液泵)，DGU-20AsR CL(在线脱气机)， SIL-30ACMp CL(自动进样器)， CTO-30A CL (柱温箱)， SPD-M20A CL(二极管阵列检测器) CBM-20A CL 系统控制器， LCMS-8050 CL 三重四极杆质谱仪，LabSolutions Ver. 5.91 色谱工作站，NeonatalVer.2.30筛查结果处理软件。 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱柱：在线过滤器(2um，P/N6010-55100) 流动相：试剂盒提供 柱温：室温 进样量：1pL 洗脱方式：流速梯度洗脱，初始流速为 0.1mL/min，时间程序见表1。 表1 梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 0.10 Pumps T.Flow 0.05 0.65 Pumps T.Flow 0.25 0.66 Pumps T.Flow 1 1.00 Controller Stop 质谱条件 分析仪器： LCMS-8050 CL DL温度：250℃ 离子源： ESI(+) 加热模块温度：400℃ 雾化气流速：3.0 L/min 离子源温度：300C 干燥气流速：10.0L/min 扫描模式：多反应监测(MRM) 加热器流速：10.0L/min MRM参数：见表2 表2 MRM 参数 名称 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias (V) CE (V) Q3 Pre Bias (V) C20：0 LPC 552.5 104.1 -22 -32 -20 C22：0LPC 580.5 104.1 -22 -32 -20 C24：0LPC 608.5 104.1 -22 -32 -20 C26：0 LPC 636.5 104.1 -22 -32 -20 C26：0 LPC-IS 642.5 104.1 -22 -32 -20 1.3材料与方法 1.3.1材料 高质控干血片：试剂盒提供 低质控干血片：试剂盒提供 内标准溶液：试剂盒提供 样品稀释液：试剂盒提供 1.3.2方法 方法原理：使用含稳定同位素标记的 C26：0 LPC 内标准品的溶剂萃取滤纸干血片中的4种溶血磷脂酰胆碱，然后用串联质谱进行分析。通过测定4种溶血种脂酰胆碱与 C26：0 LPC 同位素内标的离子峰强度，由已知水平的内标，即可通过岛津新生儿筛查软件自动计算出所测样本的4种溶血磷脂酰胆碱浓度水平。 样本前处理方法：用直径3mm打孔器在质控干血片及新生儿血片上取样，置于96孔板中，每孔加入含C26：0 LPC 同位素内标的溶液 100 uL， 45℃密封孵育震荡(650~750 rpm) 45 min， 室温放置5 min， 提取75uL萃取液转移至Ⅴ型底96孔板内，铝膜覆盖，上机检测，如图1所示。 图1 样本前处理及分析流程 结果与讨论 2.1MRM色谱图 图2低质控干血片谱图 2.2质控样本准确度考察 按1.3中的前处理方法和1.2中的分析条件对试剂盒中的高低质控干血片进行分析，高低质控干血片各处理4份，以考察准确度，使用岛津 Neonatal 新筛数据处理软件对筛查结果进行数据处理，结果见表3，结果显示，高低质控干血片中4种溶血磷脂酰胆碱均在靶值范围内，准确度良好。 表 3 保留时间和峰面积重复性结果((n=6) 目标物 _QC测定值 LQC靶值范围 HQC测定值 HQC靶值范围 C20：0 LPC 1.04 0.66~1.50 3.82 2.47~5.34 1.12 4.15 0.99 3.54 1.07 4.01 C22：0 LPC 1.00~1.99 3.09~6.43 1.55 4.70 1.58 5.15 1.32 5.13 1.41 4.52 C24：0 LPC 0.92~2.03 3.02~6.26 1.57 5.12 1.57 5.72 1.29 4.97 1.36 5.01 C26：0 LPC 0.93 0.55~1.34 4.43 2.20~5.76 1.01 4.85 0.89 4.68 0.85 4.61 2.3精密度考察 按1.3中的前处理方法和1.2中的分析条件对试剂盒中的低质控干血片连续进样分析6针，以考察仪器精密度，具体结果见表4，结果显示，连续分析6针低质控干血片 ， RSD 在1.2%-3.6%之间，仪器精密度良好，满足临床测定需求。 表4 精密度考察数据 NO. C20：0 LPC C22：0 LPC C24：0 LPC C26：0 LPC 测定1 0.99 1.32 1.29 0.89 测定2 0.91 1.28 1.28 0.84 测定3 0.98 1.28 1.27 0.89 测定4 1.00 1.31 1.33 0.92 测定5 0.95 1.30 1.26 0.87 测定6 0.94 1.30 1.28 0.88 RSD% 3.6 1.2 1.9 3.0 2.4临床样品测定结果 取10批次新生儿滤纸干血片，按1.3中的前处理方法及1.2中的分析条件进行测定，谱图见图3，结果见表5，结果显示， LCMS-8050 CL配套该试剂盒使用可以满足临床检测需求。 图3 Sample-1谱图 表5 人血清临床样品检测结果(umol/L) NO. C20：0 LPC C22：0 LPC C24：0 LPC C26：0 LPC Sample-1 0.88 0.85 1.10 0.52 Sample-2 0.54 0.48 0.63 0.33 Sample-3 0.54 0.64 0.86 0.36 Sample-4 0.84 0.64 0.95 0.38 Sample-5 0.36 0.44 0.57 0.31 Sample-6 0.52 0.50 0.74 0.35 Sample-7 0.49 0.51 0.76 0.31 Sample-8 0.67 0.72 0.95 0.37 Sample-9 0.51 0.49 0.71 0.35 Sample-10 0.49 0.63 0.84 0.34 结论 本文使用岛津临床用液相色谱三重四三杆质谱仪 LCMS-8050 CL 及X-连锁肾上腺脑白质营养不良筛查和诊断试剂盒(液相色谱-串联质谱法，质谱生物科技有限公司)，建立了干血片中4种溶血磷脂酰胆碱同时测定的方法，该方法可辅助筛查诊断X- 连锁肾上腺脑白质营养不良。使用试剂盒的内标、标准品、质控品及新生儿滤纸干血片进行了方法的准确度及精密度考察，使用岛津Neonatal新筛数据处理软件对筛查结果进行数据处理。结果显示该方法准确度及精密度均满足试剂盒要求， Neonatal 新筛数据处理软件可以应用于筛查数据处理。该方法对X-连锁肾上腺脑白质营养不良的临床判断、治疗管理和生理评估具有辅助筛查诊断的意义。 岛津应用云 本文使用岛津临床用液相色谱三重四极杆质谱仪LCMS-8050 CL及X-连锁肾上腺脑白质营养不良筛查和诊断试剂盒（液相色谱-串联质谱法，质谱生物科技有限公司），建立了干血片中4种溶血磷脂酰胆碱同时测定的方法，该方法可辅助筛查诊断X-连锁肾上腺脑白质营养不良。使用试剂盒的内标、标准品、质控品及新生儿滤纸干血片进行了方法的准确度及精密度考察，使用岛津Neonatal新筛数据处理软件对筛查结果进行数据处理。结果显示该方法准确度及精密度均满足试剂盒要求，Neonatal新筛数据处理软件可以应用于筛查数据处理。该方法对X-连锁肾上腺脑白质营养不良的临床判断、治疗管理和生理评估具有辅助筛查诊断的意义。