靶向代谢物中异构体色谱分离检测方案(液质联用仪)

应用简报 Agilent代谢组学 Trusted Answers 优化用于极性代谢物的发现代谢组学液质联用方法 Yuqin Dai 和 Jordy J. Hsiao 安捷伦科技有限公司 为了在分析中实现对多种常见内源性代谢物类别的全面覆盖，开发了高 pH 和低 pH亲水相互作用色谱 (HILIC) 法。这些方法适用于高分辨率的精确质量数 LC/Q-TOF质谱仪 (MS)。靶向代谢物类别包括维生素、氨基酸、聚胺、糖、磷酸糖、有机酸、核苷酸和辅酶 A (CoA) 衍生物。对液相色谱梯度和离子源进行了系统优化，以获得良好的异构体色谱分离效果，并获得所研究的所有代谢物类别的最佳信号响应。为验证此方法的稳定性，使用 HILIC LC/Q-TOF MS 方法运行25小时对酵母提取物进行了评估。 LC/Q-TOF MS 通常用于代谢组学中的发现工作，目的是全面表征生物体内的小分子。基于质谱的非靶向代谢组学方法会产生大量的分子特征。然而，由于代谢组学鉴定过程充满挑战，可能无法对这些特征进行高准确度的标注和鉴定。检测到的质荷比(m/z)信号通常可以匹配到几种优化代谢物数据库中可能的代谢物。因此，可靠的代谢物鉴定需要额外的物理信息，例如保留时间或来自真正标准品的 MS/MS碎片谱图。对极性代谢物的色谱分析仍然存在挑战，包括离子代谢物的保留、生物相关异构体的色谱分离以及对各种代谢物类别的广泛覆盖。 为解决这些挑战，开发了高 pH 和低 pHHILIC LC/Q-TOFMS方法，以改善对代谢组图谱的分析性能。使用多种代谢物(包括维生素、氨基酸、聚胺、单糖和二糖、磷酸糖、有机酸、核苷酸、CoA衍生物和氧化还原代谢物)作为开发色谱方法的代表性分析物。此外，还优化了安捷伦喷射流 (AJS) 源子源的条件，以获得所研究的各种代谢物的最佳分析灵敏度。最后，使用酵母提取物验证了方法的重现性、质量准确度和同位素保真度等分析性能。 实验部分 方法 选择涵盖不同化学类别的代谢物标准品和20对生物相关异构体进行 HILIC LC/Q-TOFMS 方法开发。在 Agilent InfinityLabPoroshell 120 HILIC-Z， 2.1 mm×150 mm，2.7 um， PEEK 内衬(部件号673775-924)色谱柱上，利用表1所述的两种不同的溶剂体系进行色谱分离。 使用 LC/MS 级乙腈和 Milli-Q纯水进行LC/MS分析。溶剂缓冲液的详细配制步骤如表1所示。 为了最大程度减少极性离子代谢物与系统中痕量金属的结合，向高 pH流动相中添加了 InfinityLab 去活剂添加剂(部件号5191-4506)2。 表 1.LC/MS分析的流动相配制 电离极性 10X储备缓冲液 流动相A 流动相B 流动相添加剂 高pH方法 负离子模式 (有机酸、磷酸糖、核苷酸和CoA衍生物等) 100 mmol/L 乙酸铵， pH9.0，用氢氧化铵进行调节 将100mL储备缓冲液与900mL水混合 将100mL 储备缓冲液与 50 mL水和 850 mL ACN 混合 将去活剂添加剂加入流动相A和流动相B，最终浓度为2.5 pmol/L 低pH方法 正离子模式 (氨基酸、维生素和聚胺) 100 mmol/L 甲酸铵 将100mL储备缓冲液与 900mL水混合 将 100 mL储备缓冲液与 900mL ACN混合 将甲酸加入流动相A和流动相B，最终浓度为 0.1%(v/v) 仪器 表2.最佳LC参数 使用 Agilent 1290 Infinity ll液相色谱仪与配备安捷伦喷射流离子源的 Agilent 6545LC/Q-TOF 的联用系统进行 LC/MS 分析。液相色谱仪包括： Agilent 1290 Infinity lI高速泵 (G7120A) 配备恒温箱的 Agilent 1290 Infinity IIMultisampler (G7167B) Agilent 1290 Infinity ll 高容量柱温箱(MCT) (G7116B) 等度泵 (G1310A) 和100：1 分流器 (G1607-60000)用于参比质量添加。通过连续注入参比质量溶液，实现动态质量轴校正。 表2和表3汇总了经优化的 LC 和MS条件。使用 Agilent MassHunter 软件套装进行数据采集与分析。 Agilent 1290 Infinity ll液相色谱系统 色谱柱 Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z， 2.1 mm×150 mm， 2.7 pm， PEEK 内衬(部件号673775-924) 正离子模式 负离子模式 溶剂 A) 含 0.1% FA 的10 mmol/L 甲酸铵水溶液B)含0.1%FA 的10 mmol/L 甲酸铵的水/ACN 10：90 (v：v)溶液 A) 含2.5 umol/L InfinityLab 去活剂添加剂的10 mmol/L乙酸铵水溶液， pH=9 B) 含 2.5 pmol/L InfinityLab 去活剂添加剂的10 mmol/L乙酸铵的水/乙腈15：85 (v：v) 溶液， pH=9 非线性梯度 时间(min) %B 0 983 98 11 7012 6016 5 18 5 19 98 20 98 时间 (min) %B 0 962 96 5.5 88 8.5 889 8614 8617 82 23 65 24 65 24.5 96 26 96 后运行时间 4 min 3min 柱温 25°C 50°C 流速 0.25 mL/min 进样量 3pL 自动进样器温度 4C 表3.优化的MS参数 Agilent 6545 LC/Q-TOF 电离极性 正离子 负离子 电离模式 双AJS 双AJS 气体温度 225°C 225°C 干燥气流速 6 L/min 13L/min 雾化器压力 40 psi 35 psi 鞘气温度 225°℃ 350°C 鞘气流速 10 L/min 12 L/min 毛细管电压 3000V 3500V 喷嘴电压 0V 0V 碎裂电压 125V 125V 锥孔电压 65V 45V 八极杆1RF 电压 450V 750 V 采集范围 m/z 50-1000 m/z 60-1600 MS 采集速率 1质谱图/秒 1质谱图/秒 参比质量 m/z 922.009798 m/z 68.9957 m/z 980.0163 结果与讨论 利用 Agilent HILIC-Z 色谱柱开发了两种 稳定的高性能 HILIC LC/MS 方法。使用HILIC-Z 色谱柱的优势包括：出色的分析物峰形、高耐盐性、良好的色谱保留时间重现性，以及更宽范围的 pH稳定性。为确保对广泛的代谢物类别的全面覆盖，开发了正离子和负离子模式方法。针对正离子模式对低 pH 流动相缓冲液进行了优化，便于检测三种主要的代谢物类别，包括维生素、氨基酸和聚胺(图1)。同样地，针对负离子模式对高 pH流动相缓冲液进行了优化，用于检测七种主要的代谢物类别，包括氨基酸、糖、磷酸糖、有机酸、核苷酸、能量和氧化还原代谢物，以及CoA 衍生物(图2)。为了探索使用一种流动相进行正负离子两种模式分析的可行性，我们考察了使用高 pH流动相缓冲液在正离子模式下检测氨基酸、维生素和聚胺的效果。所获结果与之前发表的数据一致，表明氨基酸、维生素和聚胺在低pH流动相下可获得更佳的峰形和信号强度。因此，使用高 pH 和低 pH方法能够最大程度地覆盖不同代谢物类别并提高分析灵敏度。 采用这些优化的方法对15对生物相关异构体进行了色谱分离(示例如图3所示)，包括亮氨酸 (Leu) 和异亮氨酸 (Ile)，2-磷酸甘油酸酯(2-PG)和3-磷酸甘油酸酯(3-PG)， 异戊烯焦磷酸 (IPP) 和二甲丙烯基焦磷酸 (DMAPP)，果糖、葡萄糖和肌 醇，葡萄糖-1-磷酸酯 (G-1-P) 和葡萄糖-6-磷酸酯(G-6-P)， 以及 5'-ADP 和 3'，5'-ADP(图3)。表4和表5展示了所研究的具有相似质量数的结构异构体和代谢物的完整列表。 图1.在正离子模式下采用低 pH流动相缓冲液分析38种代谢物标样得到的叠加提取离子色谱图 (EIC) 图3.叠加 EIC显示了六组生物相关异构体的色谱分离情况 表4.结构异构体的分离 编号 代谢物 化学式 摩尔质量 极性 分离情况 1 β-丙氨酸/L-丙氨酸/L-肌氨酸 CHNO2 89.0477 正/负 分离 2 L-a-氨基正丁酸/D，L-β-氨基异丁酸 CAH，NO， 103.0633 正/负 分离 3 马来酸/富马酸 C，HO. 116.0110 负 分离 4 甲基丙二酸/琥珀酸 CH，O 118.0266 负 分离 5 L-亮氨酸/L-异亮氨酸 CH3NO2 131.0946 正/负 分离 6 O-乙酰-L-丝氨酸/L-谷氨酸 CH，NO， 147.0532 负 分离 7 二羟丙酮磷酸/甘油醛-3-磷酸 C3H70，P 169.9980 负 分离 8 顺式乌头酸/反式乌头酸 CH06 174.0164 负 分离 9 果糖/葡萄糖或半乳糖/肌醇 C6H1206 180.0634 负 分离 10 葡萄糖/半乳糖 C6H1206 180.0634 负 共洗脱 11 2-磷酸甘油酸酯/3-磷酸甘油酸酯 CH，0，P 185.9929 负 分离 12 柠檬酸/异柠檬酸 C，Hg07 192.0270 负 部分分离 13 异戊烯焦磷酸 (IPP)/二甲丙烯基焦磷酸(DMAPP) CgH120P2 246.0058 负 分离 14 a-葡萄糖-1-磷酸酯/D-葡萄糖-6-磷酸酯 CH130，P 260.0297 负 分离 15 果糖-6-磷酸酯/果糖-1-磷酸酯 C6H130，P 260.0297 负 分离 16 a-D-甘露糖-1-磷酸酯/D-甘露糖-6-磷酸酯 C6H130，P 260.0297 负 共洗脱 17 果糖-1，6-二磷酸酯/果糖-2，6-二磷酸酯 C6H14012P2 339.9960 负 共洗脱 18 麦芽糖/a-乳糖 C2H20 342.1162 负 共洗脱 19 腺苷-5'-二磷酸(5'-ADP)/腺苷-3'，5'-二磷酸(3'5'-ADP) C10H1sN010P2 427.0294 负 分离 20 甲基丙二酰辅酶A/琥珀酰辅酶A C25H40N019PaS 867.1313 负 分离 作为方法优化的一部分，对 AJS条件进行了优化，以实现代表每种化学类别的代谢物的最佳整体分析灵敏度。图4表明，改变干燥气和鞘气温度对混标的检测影响最大。例如，在使用低 pH流动相缓冲液的正离子模式分析中，随着干燥气温度从225°℃升高至350℃，所有分析物的峰高均降低(图4A，左图)。相反，除谷氨酰胺、天冬氨酸和腐胺外，大多数分析物的响应随鞘气温度的升高而增 表5.近似同量异位代谢物的分离 组别 代谢物 化学式 摩尔质量 极性 分离情况 1 戊二酸 C，Hg04 132.0423 负 分离 L-天冬酰胺 CHN20： 132.0535 负/正 分离 L-鸟氨酸 CgH12N202 132.0899 负/正 分离 2 a-酮戊二酸 CgH，0s 146.0215 负 分离 L-谷氨酰胺 CH10N203 146.0691 负/正 分离 L-赖氨酸 C6H14N202 146.1055 负/正 分离 3 顺式乌头酸 C，H，0， 174.0164 负 分离 L-精氨酸 C6H14N402 174.1117 负/正 分离 N-乙酰鸟氨酸 CH4N20： 174.2000 正 分离 B负离子模式 干燥气温度 图4.在(A)正离子和(B)负离子模式下，优化 HILIC LC/MS 方法的 AJS 离子源参数。展示了干燥气和鞘气温度的优化结果示例 强(图4A，右图)。在使用 pH9流动相缓冲液的负离子模式分析中，随着干燥气温度从200°℃升高至350°℃，有机酸、氨基酸和糖的响应显著减小(图4B)。但是，随着干燥气温度的升高，包括磷酸糖、核苷酸、氧化还原代谢物和 CoA衍生物在内的含磷酸盐的分子的响应则有所改善(图4B)。鞘气温度的变化也使采用负离子模式方法分析的代谢物产生了相似的趋势。优化后的方法采用了表3中所示的最终干燥气温度和鞘气温度，以涵盖所测试的所有代谢物类别，但用户可根据其特定目标代谢物类别调整离子源参数。 为验证此 HIILC LC/MS 方法用于生物样品分析的稳定性，使用优化后的 pH9方法，在负离子模式下对酵母提取物进行了评估，因为该方法涵盖了通常研究的主要代谢物类别。图5显示了酵母提取物中代表性代谢物的EIC。 ×105 图5.在负离子模式下使用优化的 pH9 方法获得的酵母提取物中14种代表性代谢物的 EIC 对45种目标代谢物的色谱保留时间稳定性、信号响应和质量准确度进行了评估(图6和图7)。结果表明，在25小时的运行时间内，酵母提取物中检测到的45种代表性内源性代谢物的保留时间(%RSD<1.1%)和信号响应 (%RSD<15%)均获得了出色的重现性(图6)。此外，在这段分析时间内还获得了出色的质量准确度和精密度，其中平均绝对质量误差≤1.6 ppm， RSD s 1.2ppm (图7)，证明了仪器和 HILIC LC/MS 方法在此分析时间段内的出色稳定性。 酵母提取物中代谢物的质量数 图6.在25小时的运行时间内，从酵母中提取的代谢物获得了出色的保留时间和信号强度重现性。在负离子模式下的50次分析运行中，(A)保留时间的%RSD<1.1%， (B)信号强度的%RSD<15%(n=45种代谢物) 通过优化色谱条件，重要的生物异构体实现了优异的分析选择性，并能够检测各种代谢物。15对/组生物相关异构体和3组具有相似质量数的代谢物实现了基线分离。对 AJS 参数进行了系统优化，以获得最佳的整体分析灵敏度。最后，通过在25小时内对生物样品进行50次进样分析，验证了色谱方法和LC/MS仪器的稳定性。安捷伦液质联用系统的卓越性能使其成为代谢组学分析的出色系统。 一a删咪公 图7.在25小时的运行时间内，从酵母中提取的代谢物获得了出色的质量准确度稳定性。在负离子模式下的50次分析运行中，(A)平均绝对质量误差s1.6 ppm， (B)质量误差的 RSDs 1.2 ppm(n=45种代谢物) ( 1. Schrimpe-Rutledge， A. C . et al. J. Am. ) ( Soc. Mass Spectrom.2015 Dec， ) ( 27(12)，1897-1905 ) 2. Hsiao，J. J. et al. Anal. Chem.2018 Aug， 90(15)， 9457-9464 3. Hsiao， J. J. et al. LCGC Special Issues2018 June， 36(6)，30-35 查找当地的安捷伦客户中心： 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 仅限研究使用。不可用于诊断目的。 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 www.agilent.com/chem/contactus-cn 为了在分析中实现对多种常见内源性代谢物类别的全面覆盖，开发了高 pH 和低 pH亲水相互作用色谱 (HILIC) 法。这些方法适用于高分辨率的精确质量数 LC/Q-TOF 质谱仪 (MS)。靶向代谢物类别包括维生素、氨基酸、聚胺、糖、磷酸糖、有机酸、核苷酸和辅酶 A (CoA) 衍生物。对液相色谱梯度和离子源进行了系统优化，以获得良好的异构体色谱分离效果，并获得所研究的所有代谢物类别的最佳信号响应。为验证此方法的稳定性，使用 HILIC LC/Q-TOF MS 方法运行 25 小时对酵母提取物进行了评估。