样品中重组 hGH 和hG-CSF 治疗性蛋白质检测方案(液相色谱仪)

应用简报 Agilent生物制药Trusted Answers 小分子治疗性蛋白的高分离度体积排阻色谱分析 Sandeep Kondaveeti， Te-Wei Chu 和 Andrew Coffey 安捷伦科技有限公司 涉及聚集的蛋白质变性过程是阻碍稳定蛋白质药物制剂开发的因素之一。使用体积排阻色谱 (SEC) HPLC 测定这些蛋白质的纯度和聚集体是一种相对简单的技术。定期校准 SEC 方法可确保更好的重现性，从而提高准确性，还可及早发现样品及批次中的潜在问题。本简报将 Agilent AdvanceBio SEC 120 A 1.9 pm 色谱柱与其他供应商的亚2 pm 填料色谱柱进行了比较。对重组人生长激素 (hGH)、人粒细胞集落刺激因子 (hG-CSF)以及干扰素 a-2b (INF a-2b) 蛋白的分析结果表明， AdvanceBio 色谱柱在小分子蛋白质治疗药物应用方面具有卓越性能。 前言 近年来，生物衍生的治疗药物(称为生物制剂)的开发显著增长，广泛应用于治疗各种疾病。一些生物药物包括生长因子和细胞因子等小分子蛋白质治疗药物，它们在调节血液、肌肉和骨细胞的产生、成熟和活性方面发挥着关键作用。例如，人生长激素(hGH)用于刺激由于缺乏激素而生长缓慢或生长不正常的儿童和成人的生长。人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF)用于治疗化疗中的癌症患者，以提高被细胞毒性治疗药物降低的白细胞水平2。干扰素是一类具有多种治疗用途的糖蛋白，但会形成部分去折叠的形式以及聚集体，尤其当暴露于 pH 或热降解条件下时3。 涉及聚集的蛋白质变性过程是阻碍稳定蛋白质药物制剂开发的主要因素之一。美国药典专论方法推荐使用体积排阻色谱 (SEC) HPLC 测定蛋类蛋白质的纯度和聚集体。 SEC 是一种相对简单的技术。它依靠的是向固定相孔结构进行的简单扩散：较大的分子无法渗透到颗粒孔隙中，会首先洗脱，而较小的分子比较容易扩散到孔隙中，会较晚洗脱。 AgilentAdvanceBio SEC 120 A 1.9 um 色谱柱专为生物分子的水相体积排阻色谱 (SEC)分析而设计。这些填料颗粒采用专有技术制造，同时具备适用于分离小分子蛋白和多肽等分子的最佳孔径和孔隙体积。 设备与材料 所有化学品和试剂均为 HPLC 级或更高级别，且均购自 Sigma-Aldrich(现属于 Merck) 或 VWR Scientific。水经由Milli-Q A10 (Millipore)纯化。 ( 仪器 ) ( Agilent 1260 Infinity lI生物惰性液相色谱 仪包括： ) ( Agilent 1260 Infinity ll生物惰性泵 (G5654A) ) ( Agilent 1260 Infinity Ⅱl 生物惰性Multisampler (G5668 A )，配备样品 冷法装置(选件#100) ) ( Agilent 1260 Infinit y ll 高容量柱温箱(G7116A)，配备生物惰性热交换器 (选件#019) ) ( Agilent 1260 Infinity lI 二极管阵列检 测器 WR(G7115A)，配备生物惰性 流通池(选件#028) ) 软件 结果与讨论 蛋白质是含有酸性、碱性、中性和疏水性等多种侧链基团的复杂分子。寻求避免次级相互作用的最佳条件可能较为困难，但AdvanceBio SEC 产品系列的硅胶颗粒具有聚合物表面涂层，可以解决很多这方面的问题。分离机理是基于溶液中分子的大小(流体动力学半径)。自然界中的蛋白质通常是致密的球状结构，通常会在极端温度、pH或盐组成等应激条件下聚集，形成二聚体和更大的单元。这对于蛋白质分子而言是一个特殊问题，如果存在蛋白质聚集，在作为治疗药物分子给药时可能引发不良反应。 SEC 为蛋白质聚集的量化和监测提供了理想工具。图1展示了低分子量蛋白质和多肽标准品的 SEC 分离。这些标准品基于保留时间的校准曲线如图2所示。由此估计该色谱柱的最佳分子量范围为1-80 kDa。 图1.低分子量蛋白质和多肽混合物在0.35 mL/min 下的体积排阻色谱图 图2.低分子量蛋白质和多肽标准品的 AdvanceBio SEC 1.9 um 120 A校准曲线 即使使用 AdvanceBio SEC 色谱柱是为了定量单体和二聚体含量，使用适当的分子量标准品定期进行校准仍然是个很好的做法。定期校准可确保更好的重现性，从而提高准确性，还可及早发现潜在问题，减少系统停机时间和故障排除工作。对于蛋白质分离，应使用的标准品是一系列充分表征的蛋白质，涵盖色谱柱的整个操作范围。选择正确的标准品可确保成功应用SEC 的两个关键环节：分析物与固定相之间的次级相互作用应尽可能小。选择的孔径应匹配所分析分子的大小。 图 3.使用 Agilent AdvanceBio SEC 1.9 um 120A 4.6×300 mm 色谱柱，在0.35 mL/min 下获得的 hG-CSF的体积排阻色谱图 本应用简报展示了使用 Agilent AdvanceBioSEC 120 A 1.9 um 色谱柱对重组 hGH 和hG-CSF 治疗性蛋白质进行体积排阻色谱(SEC)分析，与当前的竞品亚2 um 填料技术相比，其可实现高分离度分离。通过进一步优化流动相条件，还比较了未降解和热降解干扰素 a-2b (IFN a-2b) 的 SEC分离。 图4展示了在 AdvanceBio SEC 1.9 um120A色谱柱和其他供应商的亚2 pm 色谱柱上获得的 hG-CSF 谱图的基线放大 图。色谱图的底端部分表明了与次级相互作用相关的问题(晚于预期洗脱时间和拖尾峰)。 将目标分析物的保留时间与校准曲线进行 比较，可以确定是否存在次级相互作用。峰洗脱时间早于或晚于预期或是峰形不佳，则表明流动相条件可能未得到充分优化。图3展示了使用 AdvanceBio SEC1.9 um 120A色谱柱获得的 hG-CSF体积排阻色谱图，其保留时间与20 kDa 左右的蛋白质的保留时间非常接近。 图 4. hG-CSF 体积排阻色谱图的放大图，流速0.35 mL/min 许多其他生物治疗性蛋白质具有相似的分子量，因此也适合在同一 AdvanceBioSEC 1.9 pm 120 A色谱柱上进行分析。重组形式的 hGH 及生长激素可能由于翻译后修饰或下游加工而含有一些杂质。图5 其他蛋白质可能需要进一步开发方法以获得最佳峰形和分离度。如表2所示，通过在不同流动相条件下进行一系列实验来确定获得最佳 IFN a-2b 峰形和蛋白质回收率的流动相组成。 表 1. hG-CSF高分子量(HMW)、二聚体和单体峰的峰面积数据 AdvanceBio SEC 1.9 pm 120 A 竞品1， 1.7 um 125 A 竞品 2， 1.8 pm 150 A RT (min) 峰面积(%) Rs USP 峰拖尾 RT (min) 峰面积(%) Rs USP 峰拖尾 RT (min) 峰面积(%) Rs USP 峰拖尾 HMW 5.22 2.61 1.16 5.59 2.49 1.28 7.40 2.01 1.37 二聚体 5.88 1.02 2.41 1.11 6.27 0.83 1.68 1.26 未检出 单体 6.82 96.37 3.77 1.13 7.31 96.68 3.04 1.11 9.74 97.99 2.13 110- Agilent AdvanceBio SEC， 1.9 pm 120 A 保留时间(min) 图5.生长激素(rhGH)的体积排阻色谱图 表 2.IFN a-2b 方法优化期间的峰形数据 NaCl(mmol/L) 峰宽(min) 拖尾 分离度 HMW-单体 分离度单体-LMW 100 0.20 2.88 1.94 1.98 150 0.18 2.65 2.25 2.31 200 0.16 2.52 2.26 2.66 250 0.15 2.39 2.84 2.86 400 0.14 2.08 3.32 3.59 图6展示了在三种不同的亚2pm SEC色谱柱上获得的干扰素 a-2b标准物质的体积排阻色谱图以及保留时间和色谱峰拖尾数据。利用 SEC 分离 IFN a-2b 杂质时，色谱柱性能的差异可能会导致分离度的不同，因此使用降解样品重复进行该实验。 对于干扰素a-2b，有研究认为聚集体的形成涉及分子的部分去折叠，但部分去折叠的分子在一定程度上是稳定的3。此外，O-糖基化也会降低这些分子的热稳定性4。由于大肠杆菌细胞系不会引入糖基化变体，因此用于生产重组蛋白的细胞系的选择是一个关键参数。 图6.干扰素a-2b的体积排阻色谱图 将干扰素 a-2b 样品进行热降解(加热到60°℃，保持30分钟)可能会引入多种杂质，包括较早洗脱的高分子量物质(HMW)以及较晚洗脱的低分子量物质(LMW)，如图7所示。与预期一致，无论 是 HMW与单体之间还是单体与 LMW 之间， 在AdvanceBio SEC 1.9 um 120A色谱柱上均获得了最大分离度。在先前未降解样品的分离中，该色谱柱获得的峰最窄，峰拖尾最小。 ( Agilent AdvanceBio S EC 提供一系列色谱柱尺寸和不同孔径，适用于不同大小 的分子。 与其他供应商类似填料粒径和孔径特征的色谱柱相比，独具特色的AdvanceBio SEC 120 A 1.9 um 色谱柱可实现对小分子治疗性蛋白质的高分离度 SEC 分析，展现出了优异的性能。 ) ( 使用适当的标准品校准AdvanceBio SEC 体积排阻色谱柱，可以确保您充分了解正 确的工作范围，并且可以通过校准曲线估 算未知分子的分子大小。但是，使用一系 列标准品进行定期校准非常有益，可以用于监测色谱柱性能随时间的变化，从而及 早发现潜在的问题。继而，可以采取纠正措施，最终缩短系统停机时间并提高分析 效率。 ) 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn ( 1. Bayol，A. et al. Pharmeuropa Bio.2004，2004(1)，35-45 ) ( 2. Advani，S. H.et al. IndianJ. Med. Paediatr. Oncol.2010 (Jul-Sep)， 31(3)， 79-82 ) ( 3. Sharma，V.K.；Kalonia， D. S.Pharmaceutical Research 2003， 20， 1721-1729 ) ( 4. Johnston， M . J. W . et al.Pharmaceutical Research 2011，28， 1661-1667 ) 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 仅限研究使用。不可用于诊断目的。 DE.1110648148 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 C安捷伦科技(中国)有限公司，2020 2020年3月30日，中国出版 5994-1829ZHCN 涉及聚集的蛋白质变性过程是阻碍稳定蛋白质药物制剂开发的因素之一。使用体积排阻色谱 (SEC) HPLC 测定这些蛋白质的纯度和聚集体是一种相对简单的技术。定期校准 SEC 方法可确保更好的重现性，从而提高准确性，还可及早发现样品及批次中的潜在问题。本简报将 Agilent AdvanceBio SEC 120 Å 1.9 μm 色谱柱与其他供应商的亚 2 μm 填料色谱柱进行了比较。对重组人生长激素 (hGH)、人粒细胞集落刺激因子 (hG-CSF) 以及干扰素 α-2b (INF α-2b) 蛋白的分析结果表明，AdvanceBio 色谱柱在小分子蛋白质治疗药物应用方面具有卓越性能。