IgG1中二硫键检测方案(二手分析仪器)

利用 Agilent 1260 Infinity 生物生性液相色谱系统及Agilent ZORBAX RRHD二苯基亚 2 um 色谱柱分析IgG1 中的二硫键 应用简报 生物制药 作者 M. Sundaram Palaniswamy 安捷伦科技公司 班加罗尔，印度 摘要 本应用简报报导了一种简易的反相 HPLC 方法，用于分析单克隆抗体(mAb)中的二硫键。其中通过 Agilent 1260 Infinity 生物惰性液相色谱系统及 Agilent ZORBAX RRHD300二苯基亚 2 pm 粒径色谱柱实现分离。在完整蛋白质及肽段消化物的反相分离中，二苯基1.8pm 色谱柱能够提供 UHPLC级别的性能。当与 UHPLC仪器联用时，这种通用型色谱柱可在更短的分析时间内获得更全面的表征结果。1260 Infinity 生物惰性液相色谱系统的耐压能力高达600 bar， 能够承受采用更低粒径(低至1.7pm)的新型色谱柱技术所要求的更高压力。 前言 虽然近年来重组 mAb 疗法取得了很大的发展，但是关于它们的二硫键模式，人们所掌握的信息很少。研究 IgG1 抗体中完整的二硫键分布极具挑战性，这是由于它们的分子量很大，并且二硫键的数目很多。对于治疗性单克隆抗体(mAb))，， 二硫键是保持免疫球蛋白 (IgG)三级和四级结构的关键因素。在 mAb 生产过程中，链间和链内的二硫键均在表达宿主细胞内形成，然后进行分泌和纯化。之前的报道指出， 对于 lgG2 及二硫化介导的 lgG4臂交换，二硫键会发生重排，反映出这些 IgG类型的一种固有行为1.2。但是，已有报道观察到 IgG1中的二硫建数目呈现出不规则的显著降低3，这对于治疗性mAb的生产而言是一个很重要的问题。本应用简报证实了1260生物惰性四元泵液相色谱系统适用于 IgG1 中二硫键的分离和分析，该系统采用反相 HPLC 方法和 ZORBAXRRHD 300二苯基， 2.1×100 mm， 1.8 pm粒径色谱普。采用亚 2 pm 粒径色谱柱的超高效液夜色谱(UHPLC)分离， 可改善每次分析的分离度和灵敏度，缩短分析时间，并且可用于分析 IgG1、还原态 lgG1，以及IgG1消化产生的肽段。 仪器设备 仪器 ( 具有完全生物兼容性的 Agilent 1260 Infinity生物惰性四元液相色谱系统，最高耐压为 600 ba r ， 由以下模块组成： ) ( · Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相 泵 (G5611A) ) ( · Agilent 1260 Infinity 生物惰性高效自动 进样器 (G5667A) ) ( · Agilen t 1200 Infinity 系列自动进样器恒 温器(G1330B) ) ( · Agilent 12 6 0 Infinity 柱 温 箱，配置生 物惰性嵌入式加热元件 (G 1 316C， 选 项19) ) ( · Agilent 1260 Infinity 二极管阵列测器，配置60mm 最大光强高灵敏度流通池 (G4212B 选项33) ) ( · Agilent ZORBAX RRHD 30 0 二苯基，2.1×100 mm ， 1.8 pm 粒径色谱柱(部件号858750-944) 。 ) 整个样品流路中不含任何金属部件，因此样品不会接触到金属表面。溶剂输送系统中不含任何不锈钢或铁质部件。 ( 软件 Agilent OpenLAB CDS ChemStation， L C 和LC MS系统版， 修订版 C.01.04 ) 试剂、样品与材料 人单克隆抗体 IgG1 是一种专利性药物分子。DL-二硫苏糖醇 (DTT)、碘乙酰胺、三羟甲基氨基甲烷碱以及蛋白内切酶 Lys C均购自美国西格玛奥德里奇公司。所有的化学品和试剂均为 HPLC级， 高纯水由Milli Q纯水系统 (Millipore Elix 10型，美国)制备。乙腈为梯度极，购自Lab-Scan 公司(泰国曼谷)。 完整 IgG1的还原和烷基化 用100 mM Tris HCI 和4M Gu HCI， pH 8.0将 IgG1稀释至2mg/mL。加入 10pL0.5MDTT储备液，使其终浓度为5mM。混合物在 37°℃下反应30分钟。然后待反应混合物短暂冷却至室温。加入26pL0.5M碘乙酰胺储备液，使其终浓度为13mM。反应45分钟。移去后加入20pLDTT以淬灭反应， 并使终浓度为10mM。 Lys C 消化 IgG1 和还原 用100 mM Tris HCI， pH 8.0 将 IgG1稀释至1 mg/mL。加入蛋白内切酶 Lys C的100 mM Tris HCI溶液， pH 8.0，其中酶和蛋白质的比例为 1：100 (w/w)。混合物在37℃下孵育过夜。然后加入10% TFA将 pH值降至6.0以停止反应。然后，使用本应用简报上文中介绍的方法还原Lys C消化后的 lgG1。 分离和检测 ZORBAX RRHD 300 二苯基 1.8 pm粒径色谱柱具有可耐受低 pH 和温度稳定性好的优势， 与耐压600 bar 以及能在更高压力下运行的1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统联用时，可用于分离蛋白质。 图1 利用Agilent ZORBAX RRHD 300 二苯基， 2.1×100mm， 1.8 pm 粒径色谱柱所得的完整 IgG1 的 RP HPLC谱图 (A)， 以及六次重复的叠加图(B) 保留时间 峰面积 平均值 (min) RSD (限值：±3.0%) 平均值(mAU/min) RSD(限值：±5.0%) 8.838 0.086 1，170 0.461 表2保留时间和峰面积 RSD (%)， 完整 IgG1， n=6 图1A展示了优化后完整 lgG1 的 RP HPLC洗脱图谱， 其中采用了 ZORBAX RRHD 300二苯基，2.1×100mm， 1.8 pm 粒径色谱柱，证实了 lgG1在15分钟内具有优异的保留性。进行6次重复实验以检测分析的重现性。图1B为6次重复实验的叠加图。 还检测了对完整 IgG1 中二硫键进行还原和烷基化的效果。图2A展示了经过还原和烷基化后的 IgG1 反相色谱图，B为与还原/烷基化缓冲液空白的叠加图， C为6次重复实验的叠加图以展示分离的重现 性。由于二硫键的还原， IgG1 被分为轻链和重链。IgG1洗脱后，存在明显的轻链(LC)和重链(HC)， 如图2中所示；但是，质谱分析未能证实这一点。 图2 (A)还原和烷基化 IgG1 的RP HPLC 谱图， (B)与缓冲液空白的叠加图， (C)六次重复的叠加图 保留时间 峰面积 平均值(min) RSD (限值：±3.0%) 平均值(mAU/min) RSD(限值： ±5.0%) 8.638 0.091 504.33 2.780 表3 保留时间和峰面积 RSD (%)， 轻链， n=6 保留时间 峰面积 平均值(min) RSD (限值：±3.0%) 平均值(mAU/min) RSD (限值：±5.0%) 9.084 0.152 1，520 0.390 表 4 保留时间和峰面积 RSD (%)， 重链， n=6 在未还原状态下， 完整 lgG1 的 Lys C消化物所得的肽图会形成复杂程度较低的RP HPLC 谱图。IgG1 消化物的代表性色谱图(图3A)中显示了两个用于峰面积和保留时间精密度评估的峰(基线分离)。叠加图中展示了尖锐的色谱峰，且具有良好的分离度和优越的分离重现性(图3B)。 此外，我们想要比较未还原和还原状态下IgG1的反相色谱图，以测定二硫键所连接的肽段。图4中展示了未还原(红线)和还还(蓝线) IgG1 的 Lys C 肽图的叠加图。还原后， IgG1 的 Lys C 消化物中出现了额外的色谱峰(以*号表示)，证实了它们由二硫键连接。 保留时间和峰面积的精密度 完整 lgG1、还原态 IgG1 和未还原状态下蛋白内切酶 Lys C 消化后的 IgG1的保留时间和峰面积精密度分别如表2、3和4中所示。结果显示 ZORBAX 二苯基亚 2 pm色谱柱的保留时间和峰面积的精密度分别在3%和5%以内。 图 3 (A) Lys C 消化后 IgG1的 RP HPLC 谱图以及(B)六次重复的叠加图。用于保留时间和峰面积RSD 检测的峰以"号标示 保留时间 峰面积 平均值(min) RSD (限值：±3.0%) 平均值(mAU/min) RSD (限值：±5.0%) 色谱峰1 5.525 0.307 60 0.544 色谱峰2 7.444 0.140 132.45 1.113 表5 保留时间和峰面积 RSD (%)， Lys C消化后 IgG1， n=6 图4 比较未还原(红线)和还原(蓝线)状态下 Lys C 消化后IgG1 的肽图。二硫键连接的肽段以“号标示 在生物制药工艺开发和监测过程中，：二硫键分析对于研究蛋白的一些翻译后修饰非常重要。我们展示了将 Agilent 1260 Infinity 生物惰性系统液相色夜系统与 Agilent ZORBAXRRHD 300二苯基，2.1×100mm， 1.8 pm粒径色谱柱联用，能够实现单克隆抗体中二硫键的可重复高分离度分析，适用于生物制药工艺开发和监测。优越的峰面积和保留时间精密度证实该方法具有可靠性。此外， 1260 Infinity 生物惰性液相色谱的耐压高达 600 bar， 能够采用压力要求更高的新型小粒径(低至1.7pm) 色谱柱技术。仪器的生物惰性和抗腐蚀性加上简单和可重复的方法，使得这种解决方案特别适合用于生物制药行业中单克隆抗体的QA/QC 分析。 参考文献 ( 1 . R. Mhatre， J. Woodard， C. Zeng， Strategies for locating disulfide bondsin a monoclonal antibody via mass spectrometry spectrometry， Rapid Commun.M a ss Spectrom. 13 (1999)2503-2510. ) ( 2. T .-Y . Yen， H . Yan ， B.A . Macher， Characterizing closely spaced， complexdisulfide bond p atterns i n p eptides andproteins by liqui d chromatography/electrospray ionization tandem m ass spectrometry， J.Mass. S pectrom. 37 (2002) 1 5-30. ) ( 3.Mullan et al . BMC Proceedings 2011，5(Suppl 8)： P110 ) www.agilent.com/chem/bio-inert ◎安捷伦科技(中国)有限公司，20132013年2月1日，中国出版5991-1694CHCN Agilent Technologies Agilent Technologies 通过 Agilent 1260 Infinity 生物惰性液相色谱系统及 Agilent ZDRBAX RRHD300 二苯基亚 2µm 粒径色谱柱实现分离。在完整蛋白质及肚段消化物的反相分离中，二苯基 1.8µm 色谱柱能够提供 UHPLC 级别的性能。当与 UHPLC 仪器联用时，这种通用型色谱柱可在更短的分析时间内获得更全面的表征结果。 1260 Infinity 生物惰性液相色谱系统的耐压能力高达 600 bar, 能够承受采用更低粒径（低至 1.7µm) 的新型色谱柱技术所要求的更高压力。