氨基酸注射液中抗氧剂的含量检测方案(二手分析仪器)

833中国生化药物杂志 Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics 2012年第33卷第6期 .高效液相色谱法测定复方氨基酸注射液 9AA)中抗氧剂的含量 阚微娜'，王沪凯 0.辽宁省食品药品检验所，辽宁沈阳110023；2.沈阳市第七人民医院，辽宁 沈阳110003) 摘 要：目的建立高效液相色谱(HPLC) 测定复方氨基酸注射液(9AA)中抗氧剂焦亚硫酸钠与L-盐酸半胱氨酸含量的方方。方法采用 HPLC 法测定。强酸型阳离子交换柱(磺化苯乙烯-二乙烯基苯共聚物)，以 0.04 mol/L磷酸溶液为流动相，柱温为50℃，检测波长为200 nm，测定焦亚硫酸钠的含量；采用Cg柱，以二硫代二丙酸为氧化剂，异硫氰酸苯酯柱前衍生化，梯度洗脱，检测波长为254 nm，测定L-盐酸半胱氨酸的含量。结果焦亚硫酸钠和L-盐酸半胱氨酸分别在0.04~0.36和4.24~38.12 mg/L范围内线性关系良好，回收率分别为98.6%和99.6%，RSD分别为0.90%和1.5%(n=9)。结论建立了准确高效的焦亚硫酸钠与L-盐酸半胱氨酸的 HPLC 测定方法，为质量标准的提高提供依据。 关键词：复方氨基酸注射液；焦亚硫酸钠；L-盐酸半胱氨酸；高效液相色谱法；抗氧剂 中图分类号：R927.1 文献标识码：A 文章编号：1005-16782012)06-0833-04 Determination of antioxidants in Compound Amino Acids Injection 9AA)by HPLC KAN Wei-na'， WANG Hu-kai’ 1. Liaoning Institute for Food and Drug Control， Shenyang 110023， China；2. Shenyang Seventh People’s Hospital， Shenyang 110003，China) Abstract：Purpose To establish HPLC methods for the determination of antioxidant sodium pyrosulfiteand L-cysteine hydrochloride monohydrate in Compound Amino Acids Injections 9AA). Methods TheMKF-CIS chromatograph column was used with the mobile phase of 0.04 mol/L H，PO. The detectionwavelength was 200 nm to determine the content of the sodium pyrosulfite. A Cis column was used forHPLC method with PITC precolumn derivation，DTDPA as oxidant agent and determing L-cysteine hydro-chloride monohydrate at 254 nm. Results The calibration curves of the two components were 0.04-0.36mg/mL sodium pyrosulfite) and 4. 24-38.12 mg/L cysteine) respectively. Their recoveries were 98.6%and 99.6%， with RSD of 0.90% and 1.5%a=9)，respectively. Conclusion The methods can accu-rately and efficiently determine sodium pyrosulfite and cysteine so as to improve the quality of injection Key words： Compound Amino Acids Injections； sodium pyrosulfite； L-cysteine hydrochloride mo-nohydrate； HPLC； antioxidant 复方氨基酸注射液9AA)系由L-组氨酸、L-苏氨酸等9种氨基酸加辅料配置而成的灭菌水溶液。由于产品中含有易被氧化的氨基酸如色氨酸，因此抗氧剂在质量保证方面担负着极其重要的作用。有文献报道，抗氧剂是影响产品颜色的最显著的因素，目前生产该品种的企业普遍采用焦亚硫酸钠与L-盐酸半胱氨酸协同作为抗氧剂使用。现行国 ( 收稿日期：2012-07-12 ) ( 作者简介：闽微娜，女，硕士研究生，主管药师，研究方向：生化 药物分析，Tel：024-25 4 25029，E-mail：kanweina@126. com 。 ) 家标准中，并未对抗氧剂的含量进行控制。输液中的亚硫酸盐对机体有一定毒性，而且另一种抗氧剂L-盐酸半胱氨酸对用比色法测定焦亚硫酸钠含量存在一定的干扰④。此外，L-盐酸半胱氨酸处方量低 0.01%)，在空气中不稳定，常用的氨基酸分析方法测定其含量较为困难。本文研究采用高效液相色谱法 HPLC)分别测定焦亚硫酸钠与L-盐酸半胱氨酸的含量，为氨基酸注射液质量标准的提高提供依据，为生产企业质量内控提供方法。 仪器与试药 岛津2010高效液相色谱系统，包括二元泵、自 动进样器、紫外检测器、柱温箱、LC-solution 工作站。 焦亚硫酸钠分析纯)、L-盐酸半胱氨酸批号07K8421，纯度：≥98%)对照品，Sigma 公司；氨基酸原料组氨酸、苏氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、醋酸赖氨酸及L-盐酸半胱氨酸)，由辽宁某企业提供；复方氨基酸注射液9AA)，湖北某公司批号：101203)和某研发单位中样品批号：20110601，20110602，20110603)；二硫代二丙酸及硼酸盐缓冲液，美国安捷伦公司。 2 方法与结果 2. 1 焦亚硫酸钠 2.1.1 色谱条件 色谱柱：SHODEX Sugar SH1011200 mm×8 mm，6 pm)，填充剂为磺化交联的苯乙烯-二乙烯基共聚物阳离子交换树脂 H*)，以0.04 mol/L磷酸溶液为流动相，柱温为50℃，检测波长为200 nm。 2.1.2 溶液的配制 取供试品1mL，置5mL量瓶中，加水稀释至刻度，作为供试品溶液。 取焦亚硫酸钠约10 mg，精密称定，置50 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为对照品溶液。本液临用新配，并密闭保存。 按照处方量称取9种氨基酸及L-盐酸半胱氨酸原料，配制成辅料溶液。 2.1.3 测定方法 分别精密量取对照品溶液和供试品溶液各20uL，注入液相色谱仪。记录色谱图图1)，按外标法以峰面积计算供试品中焦亚硫酸钠的含量。 1.焦亚硫酸钠 图1 焦亚硫酸钠对照品溶液A)、供试品溶液B)和辅料溶液 C)HPLC 色谱图 2.1.4 线性关系试验 取焦亚硫酸钠适量，精密称定，加水制成含焦亚硫酸钠0.04，0.12，0.20，0.28和0.36 mg/mL的溶液，按2.1.3项下方法测定，以峰面积(Y)为横坐标，浓度X)为纵坐标，进行线性回归，回归方程为：Y=16744X-197，r=0.999 5，在0.04~0.36 mg/mL 范围内线性关系良好。 2.1.5 定量限测定 取浓度为 0.04 mg/L 溶液加水稀释1000倍，制成含焦亚硫酸钠0.04 ug/mL的溶液，按2.1.3项下方法测定，信噪比为10，方法定量限为0.04 ug/mL。 2.1.6 精密度试验 取0.20 mg/mL焦亚硫酸钠溶液，连续进样5次，峰面积 RSD 为 1.1% a=5)，方法精密度良好。 2.1.7 回收率试验 按照处方比例称取焦亚硫酸钠及其他成分原料，用水溶解，分别配制成相当于供试品浓度 80%，100%及120%的溶液各3份，作为回收率样品溶液，按2.1.3项下方法测定其含量，并计算回收率，结果见表1。平均回收率为98.6%，RSD a=9)为0.90%。 2.1.8 溶液稳定性试验 取0.20 mg/mL 焦亚硫酸钠对照品溶液，分别于0，2，4h进样，对照品溶液 加入量/mg/mL) 测得量/ mg/mL) 回收率/% 0.161 7 0.160 2 99.07 0.1616 0.159 1 98.45 0.1629 0.1614 99.08 0.2042 0.2001 97.99 0.203 7 0.2042 100.25 0.202 9 0.201 1 99.11 0.2461 0.240 9 97.89 0.2482 0.241 3 97.22 0.249 3 0.245 2 98.36 在4h内不稳定，因此对照品溶液应临用新配。 取样品品液，混匀，室温放置2h，分别于0，2，4，6h 进样，RSD 为1.2%，溶液在6h内稳定性良好。 2.1.9 重复性试验 取同一批号样品，分别制备供试品溶液6份，进行重复测定，含量的 RSD 为1.2%a=6). 2.1.10 样品测定 按2.1.2项下方法制备供试品溶液，按2.1.3项方方法测定，4批样品中焦亚硫酸钠的浓度均为0.9 mg/mL。 2.2 L-盐酸半胱氨酸 2.2.1 色谱条件 色谱柱： Kromasil 100-5Cj； 4. 6 mm×250 mm，5 pm)，流动相A相为0.1 mol/L醋酸钠溶溶 pH 6.5)-乙腈 93：7)，B相为乙腈-水4：1)，流动相梯度见表2，柱温为36℃，检测波长为254 nm。 表2 L-盐酸半胱氨酸含量测定流动相梯度表 时间/min A相/% 0~13.5 13.5~14.0 14.0~23.5 0 23.5~29.0 100 2.2.2 溶液的配制 取供试品1mL，置5 mL量瓶中，加水稀释至刻度，作为供试品溶液。 取L-盐酸半胱氨酸约10 mg，精密殊定，置50mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，取1mL，加水稀释至5mL，作为对照品溶液。 按照处方量称取9种氨基酸原料及焦亚硫酸钠，配制成辅料溶液。 2.2.3 测定法 取对照品供试品)溶液0.5mL，加入二硫代二丙酸0.5 mL，80℃水浴反应30 min，放冷，取0.5 mL，加入1 mol/L 三乙胺乙腈溶液0.25mL，0.2 mol/L异硫氰酸苯酯 PITC)乙腈溶液0.25mL，摇匀，室温放置1h。按2.2.1项下方法测定，记录色谱图图2)，并按外标法以峰面积计算含量。 图2 L-盐酸半胱氨酸对照品溶液A)、供供品溶液B)和辅料溶液 C)HPLC色色图 线性关系试验 取L-盐酸半胱氨酸对照品 适量，精密称定，加水制成含L-盐酸半胱氨酸4.24， 12.71，21.18，29. 65 和 38. 12 mg/L 的溶液，按 2.2.3项下方法测定，以峰面积(Y)为横坐标，浓度X)为纵坐标，进行线性回归，回归方程为：Y=5 460 366X-6570，r=0.998 8，在4.24~38.12mg/L的范围内方法线性关系良好。 2.2.5 定量限测定 取0.04 mg/LL-盐酸半胱氨酸溶液，按2.2.3中方法测定，信噪比为10，方法定量限为0.04 mg/L。 2.2.6 精密度试验 取21.18mg/LL-盐酸半胱氨酸溶液，连续进样5次，峰面积 RSD 为 0.9%6=5)，方法精密度良好。 2.2.7 回收率试验 按照处方比例称取L-盐酸半胱氨酸原料及其他成分原料，用水溶解，分别配制成相当于供试品浓度80%，100%及120%的溶液各3份，作为回收率样品溶液，按2.2.3中方法测定其含量，并计算回收率，结果见表3。平均回收率为98.6%，RSDa=9)为0.90%。 2.2.8 溶液稳定性试验 取样品原液，按2.2.2项制成供试品溶液，按2.2.3项方法测定，分别于0，2，4，6h进样测定，峰面积RSD 为0.7%a=4)，溶液在6h内稳定性良好。 2.2.9 重复性试验 取同一批号样品，分别制备供 表3 L-盐酸半胱氨酸回收率试验结果 加入量/mg/mL) 测得量/mg/mL) 回收率/% 0.015 7 0.0153 97.45 0.016 1 0.0159 98.76 0.0162 0.016 4 101.23 0.020 2 0.0200 99.01 0.0203 0.0204 100.49 0.0209 0.0211 100.96 0.024 1 0.0244 101.24 0.0248 0.0243 97.98 0.025 3 0.025 2 99.60 试品溶液6份，进行重复测定，含量的 RSD 为0.86%a=6). 2.2.10 样品测定 按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.2.3项方法测定，并计算L-盐酸半胱氨酸的含量，结果三批中试样品的含量相对于标示量的百分含量)依次为101.3%，107.1%及95.4%，市售样品为90.8%。 3i讨论 文献[4]介绍的氧化还原比色法操作复杂，结果准确度低，L-盐酸半胱氨酸作为较强的还原剂，也对测定结果有一定的影响。 HPLC 法能够高效快速的测出焦亚硫酸钠的含量，而且准确度高，其它辅料对测定不存在干扰。 在与其它氨基酸共存的条件下，含硫氨基酸的 定量较为困难，尤其是L-盐酸半胱氨酸在空气中极其不稳定，更为定量带来了一定难度。处方中L-盐酸半胱氨酸作为组合使用的抗氧剂，强还原剂焦亚硫酸钠及其蛇氨基酸的存在，更为L-盐酸半胱氨酸的定量带来了一定的难度。目前测定L-盐酸半胱氨酸多使用过甲酸将其氧化成稳定的化合物后，再使用氨基酸分析仪进行测定，而很多生产企业并没有配备氨基酸分析仪这类大型且用途专一的分析仪器，为企业质控带来了一定的难度。 本文采用二硫代二丙酸为氧化剂，将L-盐酸半胱氨酸氧化成为稳定的化合物，再使用异硫氰酸苯酯法柱前衍生化，用 HPLC 法测定，得到了较好的测 定L-盐酸半胱氨酸的方法，为生产企业的质控提供依据。 ( 参考文献： ) ( [1 ] 邹莹莹，杨士友，田 军.抗氧剂在药物制剂方面的应用[]. 安徽医药，20 0 8，12(1 ) ：1 0 96-1098. ) ( 2] 中华人民共和国卫生部药品标准[S].二部第六册生化第一 分册). 1 989：79- 8 0. ) ( [3] 胡容融.氨基酸输液中抗氧剂亚硫酸盐的控制与测定.广东药学院学报，2001，174) ： 2 8 3-284. ) ( [4 ] 吴小曼，纪 宇.比色法测定复方氨基酸注射液 08AA-I)中 焦亚硫酸钠的含量[].中国 药 品标准，2007，85)：38-40. ) ( 5] 纪 宇.比色法测定复方氨基酸注射液18AA-Ⅲ ) 中的半胱氨酸[ . 中国生化药物杂志，2006，27 6)：367-368. ) 高效液相色谱法测定麝香风湿片中乌头碱的含量 李明梅 盐城卫生职业技术学院，江苏盐苏224005) 摘 要：目的建立麝香风湿片中乌头碱含量的高效液相色谱测定方法。方法采用 Agilent Cjs柱(4.6 mm x150 mm，5 pm)；流动相：甲醇-0.05%磷酸溶液(含0.04%三乙胺)(68：32)；流速0.8 mL/min；检测波长：235 nm；柱温：30℃；进样量：10p.L。结果乌头碱在0.2006~20.06 pg/mL浓度范围与峰面积呈良好线性关系，r=0.999 9，最低检测限约为2 ng，平均回收率为97.7%。结论此方法具有快速、简便、灵敏、准确等特点，适合于麝香风湿片中乌头碱的含量测定。 关键词：麝香风湿片；乌头碱；含量测定；高效液相色谱法 中图分类号：R927.2 文献标识码：A 文章编号：1005-16782012)06-0836-03 Research on the HPLC method for determining the content of aconitine inShexiang Fengshi tablets LIMing-mei Yancheng Health Vocational Technical College， Yancheng 224005， China) Abstract：Purpose To develop a method for deteminating aconitine in Shexiang Fengshi tablets byHPLC. Methods The Agilent Cis 4.6 mm×150 mm，5 pm) was used. With a mobile phase of metha-nol-0.05% phosphoric acid solution contained 0.04% triethylamine)68：32)， the flow rate was 0.8mL/min， the detection wavelength was 235 nm， the column temperature was 30℃，and the injection was10 pL. Results The linearity of peak area was good in the range of 0. 200 6-20.06 pg/mL(=0.999 9). The average recovery was 97.7%. Conclusion This method is convenient and accurate. Theresults of experiment were satisfactory. Key words： Shexiang Fengshi tablet； aconitine； determination； HPLC ( 收稿日期：2012-07-12 ) 麝香风湿片主要由制川川、全蝎、乌梢梢、地龙、蜂房、麝香、黑豆等组成，用于风湿寒痹，关节疼痛， ( 作者简介：李明梅，女，副教授，主要研究方向：化学分析，药物分析。 ) ?China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http：//www.cnki.net 目的：建立高效液相色谱（HPLC）测定复方氨基酸注射液（9AA）中抗氧剂焦亚硫酸钠与L-盐酸半胱氨酸含量的方法。结果：焦亚硫酸钠和L-盐酸半胱氨酸分别在0.04～0.36和4.24～38.12mg/L范围内线性关系良好，回收率分别为98.6%和99.6%，RSD分别为0.90%和1.5%（n=9）。结论：建立了准确高效的焦亚硫酸钠与L-盐酸半胱氨酸的HPLC测定方法，为质量标准的提高提供依据。HPLC法能够高效快速的测出焦亚硫酸钠的含量，而且准确度高，其它辅料对测定不存在干扰。