PEG 偶联重组蛋白注射剂中吐温 20（聚山梨酯 20）检测方案(液相色谱仪)

应用简报 Agilent制药与生物制药Trusted Answers 使用反相高效液相色谱-蒸发光散射法(RP-HPLC-ELSD) 对 PEG 偶联重组蛋白注射剂中的吐温20(聚山梨酯 20)进行分析 作者 摘要 张婷婷，鲁锐 安捷伦科技有限公司 本文介绍了利用 Agilent 1260 Infinity Ⅱl四元液相色谱系统、Agilent 1290 Infinity II ELSD检测器和 Agilent Poroshell 120 SB-C18， 3.0 mm x150 mm， 2.7 pm 色谱柱对 PEG 偶联重组蛋白注射剂中的吐温20进行定量分析的简单灵敏的方法。该方法采用含三氟乙酸(0.1% TFA) 的乙腈和水溶液为流动相，以梯度条件对注射剂中吐温20进行分离分析。该方法操作方便，灵敏度高，具有良好的线性关系、精密度和准确度，为生物制药企业测定PEG 偶联的一类重组蛋白制剂中的吐温20辅料提供一种可选的解决方案。 图1. RP-HPLC-ELSD 液相色谱法测定 PEG 偶联重组蛋白注射剂中吐温20的含量 随着生物技术的高速发展，生物制剂研究着重应用于多肽、蛋白、酶、激素、疫苗、细胞生长因子及单克隆抗体等领域。但是由于生物大分子具有天然的不稳定性，因此通常将吐温等药用辅料添加到制剂中，以保证生物制剂的稳定性和安全性。 吐温20(聚山梨酯 20， Tween 20) 是一种非离子表面活性剂，具有较强的亲水性和化学稳定性，对药物有较好的助溶作用，添加到药物制剂中可提高其有效成分的溶解度。同时，吐温20 能够抑制大分子蛋白药物的自动聚合，提高蛋白药物的稳定性。目前文献报道的吐温分析方法比较多，包括HPLC-ELSD 1-2HPLC-DAD3、HPLC-CADA和LCMS5等方法。在实际蛋白制剂中的吐温分析中，这些分析方法由于受到不同蛋白药物的影响，各有其优缺点。 本文建立了一种分析吐温20 的 RP-HPLC-ELSD 方法， 该方法在直接进样 PEG 偶联的蛋白注射剂后，即可对其中的辅料吐温20进行准确的定量分析。 试剂和样品 吐温20购自南京威尔药业股份有限公司(注射级)；聚乙二醇(PEG， MW20000)购自 JenKem Technology。三氟乙酸(TFA)为HPLC级， 购自 DikmaPure 公司；乙腈为 HPLC 级， 购自J.T.Baker 公司(美国)。高纯水来自 Milli-Q纯水系统(美国)现制备。 含吐温20的 PEG 偶联重组蛋白注射剂、不含吐温20的阴性样品和不含吐温20的空白辅料(含 PEG 等其它辅料)均由生物制药厂家提供。 仪器和设备 采用最高耐压达600 bar 的 Agilent 1260 Infinity 四元液相色谱系统，由以下模块组成： - Agilent 1260 Infinity II Flexible Pump 四元梯度泵(部件号G7104C) - Agilent 1260 Infinity II Multisampler 自动进样器(部件号G7167A) - Agilent 1260 Infinity MCT 柱温箱(部件号 G7116A) - Agilent 1290 Infinity II ELSD 蒸发光散射检测器(部件号 G7102A) 利用 Agilent OpenLab CDS 2.4软件进行仪器控制和数据分析。 RP-HPLC 色谱条件 色谱柱： Agilent Poroshell 120 SB-C18， 3.0 mmx150 mm，2.7 pm， 部件号683975-302 (T) 柱温： 50°C 进样量： 10pL 流速： 0.5 mL/min 检测器： ELSD 雾化温度： 50°C 蒸发温度： 70°C 气体流速： 1.80 SLM 流动相A： 0.1% TFA 的水溶液 流动相B： 0.08% TFA 的乙腈溶液 梯度程序： 时间(min) B(%) 0 5 5 5 6 15.1 5 20 5 柱后阀切换：0-7.5min： 1-2，至废液 7.5-9.5 min： 1-6， 至 ELSD 9.5-20 min： 1-2， 至废液 图2.柱后阀切换示意图 SEC-HPLC 色谱条件 色谱柱： AdvanceBio SEC 130A， 4.6×300 mm，2.7 um，部件号：PL1580-5350 柱温： 30°℃ 进样量： 10 pL 流速： 0.5 mL/min 检测器： ELSD 雾化温度： 50°C 蒸发温度： 70°C 气体流速： 1.80 SLM 流动相： 乙腈：20 mmol/L甲酸铵=2：8 校准曲线绘制 利用浓度范围为 10-200 pg/mL 的5个吐温20校准标样，对各浓度下的平均峰面积对分析物浓度作图，得到校准曲线。 样品前处理 方法一：取待测样品溶液(空白辅料、阴性样品或蛋白注射剂)，过 0.22 um 有机滤膜，直接进样分析。 方法二：取1.0 mL待测样品溶液到离心管中，加入1.0 mL 乙并混匀；静置一段时间后进行高速离心(13200 r/min， 5 min)；然后取上清液，过0.22 um 有机滤膜后进样分析。 吐温20 的RP-LC分析 比较了不同分离模式 (SEC 和 RP) 对PEG 关联重组蛋白注射剂中吐温20的分离结果。 SEC 是分离蛋白溶液中辅料的常见方法。本实验中的蛋白分子量比较小 (19 kDa， PEG 修饰后为39 kDa)， 选择孔径为130A的色谱柱，并以乙腈和甲酸铵为流动相进行分析。吐温20在此SEC 条件下色谱峰比较宽，灵敏度不高，且会受到前面蛋白色谱峰和后面缓冲盐色谱峰的影响(如图3所示)。 图3.利用 AdvanceBio SEC 130A 色谱柱在 SEC 分离模式下 PEG 偶联重组蛋白注射剂中吐温20的色谱图 因此，本文选择 RP-LC 方法分析吐温20。在 Poroshell 120 SB-C18色谱柱(3.0mmx150 mm， 2.7 pm) 上，吐温20主峰的保留时间在8.5 min 左右，峰对称性好，灵敏度高。由于吐温20是聚氧乙烯去水山梨醇单月桂酸酯和一部分聚氧乙烯双去水山梨醇单月桂酸酯的混合物，因此主峰后面还存在其它色谱峰。考虑到吐温20的稳定性，我们以其中的主峰峰面积来定量分析制剂中吐温20的含量(建议以相同批次的吐温20来定量分析对应批次的 PEG偶联重组蛋白注射剂)。在该色谱条件下，注射剂中的缓冲盐未得到保留，在死时间出峰， PEG 和 PEG 偶联重组蛋白在吐温20后出峰，与吐温20分离较好。整体分析时间为20 min，如图4所示。 图4.利用 Poroshell 120 SB-C18色谱柱以及含 TFA 的乙腈/水流动相梯度获得的 PEG偶联重组蛋白注射剂中吐温20的RP-LC-ELSD 色谱图 前处理方法优化及柱后阀切换技术的使用 由于 PEG 偶联重组蛋白注射液中包含6 mg/mL 蛋白质，初始考虑优化前处理方法以提高吐温20分析效率。比较蛋白注射剂过滤后直接进样和用有机溶剂沉淀蛋白离心后过滤进样所得到的结果，用乙腈沉淀蛋白质(前处理方法二)后，吐温20色谱峰后仍然存在 PEG 关联蛋白质色谱峰，且影响吐温20的回收率，如图5所示。其可能的原因是：该重组蛋白分子量较小(19 kDa)，PEG 修饰提高了重组蛋白在高浓度乙腈条件下的稳定性，不利于乙腈沉淀蛋白，故采用过滤后直接进样的方法。 图5.未进行乙腈沉淀(蓝色)及进行乙腈沉淀(绿色)的 PEG 偶联重组蛋白注射液色谱图 考察 PEG 偶联重组蛋白注射剂过滤后直接进样，吐温20和其它物质在该 RP-HPLC 条件下分离结果良好。但是，考虑到蛋白注射剂中包含的高浓度蛋白以及各种缓冲盐和辅料对通用型检测器ELSD 产生较重的负担，因此在色谱柱后，进 ELSD 检测器之前安装一个柱后切换阀。该阀将经过色谱柱分离的缓冲盐(吐温20色谱峰之前)和重组蛋白(吐温20色谱峰之后)等物质切换到废液中，避免长期分析时污染 ELSD， 保证整个 RP-HPLC-ELSD系统的稳定性(见图6)。 图6.包含吐温 20 的 PEG 重联重组蛋白注射剂色谱图：A.直接进样；B.经过柱后阀切换 保留时间和峰面积的精密度 如表1所示，吐温20重复进样5次得到的平均保留时间和峰面积的相对标准偏差 (RSD) 值。保留时间和峰面积的 RSD 分别为0.03%和1.33%，表明该方法具有出色的重现性和系统精密度。 表1.保留时间和峰面积积精密度(n=5) 1 2 3 4 5 RSD 保留时间(min) 8.668 8.665 8.667 8.665 8.661 0.03% 峰面积 42.050 41.892 42.343 40.884 41.977 1.33% 检测限和定量限 将信噪比(S/N)>3时的最低浓度定义为 LOD， 将S/N>10时的浓度定义为 LOQ。由此计算出的吐温20 的LOD 和 LOQ分别为5pg/mL 和 10 pg/mL。当吐温 20进样浓度为 10 g/mL 且进样量为 10 pL时， S/N达到24，远远高于S/N>10的要求(如图7所示)。这表明采用 RP-HPLC-ELSD方法的灵敏度很高，可以满足客户分析蛋白注射剂中低浓度吐温20含量的要求(样品中吐温20含量 40 pg/mL 左右)。 图7.浓度为 LOQ的吐温20的色谱图 线性 使用峰面积的对数与吐温20浓度的对数绘制浓度范围为10-200 pg/mL的校准曲线，结果如图8所示。表明该方法在该浓度范围内具有良好的线性，相关系数(r)大于0.999. 图8.浓度范围为10-200 pg/mL 的吐温20的双Log曲线 实际样品分析 对客户提供的已知吐温20准确含量(40 pg/mL) 的重组蛋白注射剂和空白辅料溶液以及不含吐温20的阴性样品溶液进行分析，结果如图9所示。蛋白注射剂和空白辅料溶液中的吐温20含量分别为40.4 pg/mL和 38.9 ug/mL， 分析准确度满足要求(客户要求偏差在±10%内)。 图9.样品色谱图：A.含吐温20的蛋白注射剂；B. 20 ug/mL 吐温20标准溶液； C. 不含吐温 20的阴性样品溶液；D.含吐温20的空白辅料溶液 结论 本文介绍了一种对实际 PEG 偶联重组蛋白注射液中吐温20进行高效分离的方法。该方法采用 Agilent 1260 Infinity Ⅱl四元液相色谱系统、1290 Infinity lI ELSD 检测器和 Poroshell 120 SB-C18色谱柱。1290 Infinity II ELSD 为吐温20提供了较高的检测灵敏度和较好的精密度结果。吐温20 的 LOD 和 LOQ 分别为 5 pg/mL 和10 pg/mL， 在10-200 pg/mL 浓度范围表现出良好的线性，且实际样品的测定值在理论值的±10%范围内，表明该方法可以实现准确定量分析。针对客户测定实际重组蛋白制剂(如偶联 PEG)中吐温20的分析需求，本文所述的方法可作为一种可靠的解决方案。 ( 1. 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