人血液中常见毒品残留量检测方案(液相色谱仪)

分析试验室Chinese Journal of Analysis LaboratoryVol. 30. No.102011-10第30卷第10期2011年10月 高效液相色谱-串联质谱法检测人血液中常见毒品残留量 张睿，王海涛*2，吴斌，姚燕林，陶宏锦，丁永健，段宏安，刘建，徐聪林，徐文科(1.江苏出入境检检检疫局，南京210001；2.连云港出入境检验检疫局，连云港222042) 摘 要：对人血液中邪片类、苯丙胺类、可卡因类等26种毒品的提取方法、净化方法、色谱条件及质谱条件进行了研究，建立了液相色谱-串联质谱法检测人血液中26种常见毒品的检测方法。方法检测限为1~2 ug/kg。在2~200 ug/kg范围内，相关系数为0.9771~0.9995。在5~50 pg/kg 范围内，26种常见毒品的回收率在63%~104%之间，相对标准偏差为1.3%~14%。方法能够满足日常快速检测工作要求。 关键词：高效液相色谱-串联质谱；检测；毒品；人血液 中图分类号：0657.63 文献标识码：A 文章编号：1000-0720(2011)10-071-04 人体内毒品检测方法有免疫测试法、气相色谱法"、液相色谱法、气质联用法3.4及毛细管电泳法，也有使用液相色谱-质谱联有法进行检测，但多为单项目或一类毒品的检测方法。检验检疫部门对出入境人员尿液进行毒品检测的方法主要采用胶体金技术快速检测吗啡和甲基安非他明，假阳性率极高，而且采用尿样检测有可能出现逃检现象。 本研究对26种常见毒品展开研究。通过提取、净化方法、色谱及质谱条件的优化，建立了血液中26种毒品的液相色谱-串联质谱法。方法简单、快速、灵敏，可用于出入境检验检疫、疾病控制中心、公安部门快速检测及阳性结果的确证，而且由于是采血检测毒品，有效防止了逃检现象的发生，有力提高检验检疫系统的把关能力。 实验部分 仪器与试剂 TSQ Quantum Ultra AM 液相色谱-三重四极杆质谱联用仪； WH -866 涡旋混合器(太仓科教仪器厂)；R-200旋转蒸发仪(瑞士 BuCHI公司)；Milli-Q超纯水纯化系统(美国 MILLIPORE 公司)； 3K30高速离心机(美国 Sigma 公司)。 甲醇、乙腈为色谱纯(美国FISHER 公司)；NaoH、NaH，PO4、甲酸、氨水、乙酸乙酯为分析纯；毒品标准品为江苏省公安厅赠送，纯度均大于98%. 1.2 样品处理 称取2.00 g试样，置于50 mL具塞离心管中，加入1 mL 0. 1 mol/ L NaOH 溶液，10 mL 乙酸乙酯，在旋涡混匀器上充分混匀1 min， 4000 r/min 离心10 min，吸取上层乙酸乙酯于试管中。加入0.2 mL1.0 mol/L NaH，PO4 溶液后，在旋涡混匀器上充分混匀1 min，加入 10 mL 乙酸乙酯重复提取1次，合并2次提取液。提取液40℃N，吹干。加入1mL甲醇-水(V/V，30：70) 溶解定容，0.25 u.m 滤膜过滤进瓶，用液相色谱-串联四极杆质谱仪进行测定。 1.3 液相色谱分析条件 色谱柱： Phenomenex Gemini Cs柱(100mm×2.0 mmii. d.，3um)；柱温：30℃；流速：250 pL/min；进样体积：25pL；流动相：A相为0.2% NH， ·H，0 溶液，B相为甲醇；梯度洗脱程序为：0~0.5min，90% A； 0.5 ~3min，90%~5%A； ( 收稿日期：2011-04-08； 修 订日期：2011-06-20 ) ( 基金项目：江苏出入境检验检疫局科技项目(2008KJ28)资助 ) ( 作者简介：张 睿(1971 - )，男，高级工程师，E-mail： zr923@163. com ) 3~7 min，5% A；7.0~7.1 min，5%~90%AA；7.1~9 min，90%A. 1.4 质谱分析条件 离子源：电喷雾离子化源(ESI)；扫描模式：正 离子模式；检测方式：选择反应检测(SRM)；电喷雾电压：2500V；毛细管温度：350℃；干燥气温度：400℃；碰撞气：高纯度氮气；监测离子对及碰撞能量见表1. 表1 ESI-MS/MS 监测离子及对应碰撞气能量 Tab.2 Monitoring ions and corresponding collision energies of the abused drugs by ESI-MS/MS 毒品 保留时间 监测母离子 监测子离子 碰撞气能量 t/min m/z E/ev 苯丙胺 4.75 136.2 91.1"，119.2 17，28 甲基苯丙胺 5.25 150.2 91.1，119.2 19，20 苯佐卡因 4.30 166.1 102，138 18，10 3，4-亚甲基二氧基苯丙胺 4.68 180.1 105.2，163.1 21，18 3，4-亚甲二氧甲基苯丙胺 5.10 194.1 135，163 20，12 咖啡因 3.58 195.1 110.1，138° 22，18 氯胺酮 4.79 238.1 125°，179 29，17 杜冷丁 4.98 248.2 91.1，174.1 41，19 安定 5.00 285 154，193 26，30 吗啡 3.86 286.1 165.1*，201.1 39，25 去甲羟基安定 4.70 287 104，241*，269 32，23，14 舒乐安定 4.62 295.1 205，267 38，23 可待因 4.46 300 165.1*，199，251 39，29，23 利眠宁 4.87 300.1 227*，283 30，15 阿普唑仑 4.69 309.1 165.1，281.1 29，25 美沙酮 6.07 310.2 105，265 27，14 蒂巴因 4.76 312.1 221，249 23，15 四氢大麻酚 6.90 315.2 193*，259.1 22，18 劳拉西泮 4.66 321 275*，303 22，14 咪达唑仑 4.93 326 209，291 33，25 氯氮平 5.32 327.1 192，270* 42，22 乙酰可待因 4.75 342.1 165，225.1 42，25 三唑仑 4.63 343.1 165，308 29，25 海洛因 4.59 370.1 165*，211，268 46，29，26 那可汀 5.13 414.1 220*，353 21，22 地芬诺酯 5.97 453.1 165，187.1*，249 40，30，28 *定量离子 2 结果与讨论 2.1 流动相选择 有机相选择甲醇，水相选择0.1%甲酸水溶液、10 mmol/L 乙酸铵水溶液和0.2% NH，·H，0溶液进行研究，发现使用0.1%甲酸溶液灵敏度最高，0.2%NH，▪·H，0溶液灵敏度最弱。但在0. 1%甲酸和10 mmol/L 乙酸铵体系中，吗啡在色谱柱上不保留，在死时间出峰，在0.2%NH， ·H，0体系中，吗啡保留时间达到3.87 min。 主要原因是毒品很多是有机胺类化合物，酸性条件使其离子 化，在Cl8柱上保留变差。而在NH，·H，0体系中，化合物为分子形式，在非极性的C1g柱上产生了良好的保留。综合考虑各因素之后，觉得正离子模式下采用NH，·H，0-甲醇体系能获得较好的分离效果，灵敏度虽然没有甲酸-甲醇体系高，但最低检测限仍能达到1.0~2.0 pg/kg，能够满足检测要求。 2.2 质谱条件 选择 ESI 正离子模式，26种毒品均得到了良好的响应，而且可以得到丰度比较高的分子离子峰和子离子峰，选择监测离子作为定性定量依据(见 表1)，保证了灵敏度和准确性。 2.3 提取溶剂选择 考察了乙腈和乙酸乙酯两种常见溶剂对26种毒品提取效率的影响，实验结果表明，用乙腈提取样品去干扰效果差，苯丙胺、苯佐卡因和 MDA 背景干扰严重，四氢大麻酚没有回收，而乙酸乙酯提取，样品相对比较干净，四氢大麻酚回收率达到70%左右。同时考察了溶液酸碱性对提取效率的影响情况。实验结果表明，用乙酸乙酯中性条件下提取，有些如吗啡等碱性较强的化合物的回收率比较低，而且杂质干扰较明显，而加入1mL0. 1 mol/ L NaOH 溶液后再提取，这些化合物的回收率较好，基线平稳。 2.4 净化方式 通过质谱仪的在线切换功能进行了净化，用来 降低样品对质谱仪器的污染。具体操作是通过质谱仪上的在线切换阀，在目标化合物没有出峰之前和所有组分都已经流出色谱柱后，将色谱柱流出的溶液切换到废液中，不进质谱分析，质谱只分析组分流出这一时间段的流出液。这样组分流出前的大量低保留的盐和杂质及组分流出后的强保留的弱极性的化合物都没有进到质谱的离子源，有效的降低了样品对质谱的污染。 2.5 线性关系和检出限 在2~200 ug/kg范围内配制一系列不同浓度的基质混合标准溶液进行测定，以各组分的峰面积(Y)对质量分数(w，ug/kg)绘制标准曲线，结果表明，26种毒品在2~200 pg/kg范围内线性良好，相关系数为 0.9771~0.9995，可以满足定量分析的要求。线性方程、相关系数及检测限见表2. 表2 线性方程和最低检出限 Tab.3 Linear equations and limits of detection Drug 线性方程 LOD 加入量 回收率 RSD w/(ug/kg) w/(ug/kg) /% /% 乙酰可测因 Y= 9.973×105+4.874×10w 0.9956 2 5， 10， 50 88，91，91 8.4，7.0，3.2 阿普唑仑 Y= 3.046×10+2.645×10°w 0.9927 1 5，10，50 94，86，83 9.4，9.9，9.2 苯丙胺 Y=7.205×105+7.122×10w 0.9975 2 5，10，50 81，78，83 6.7，7.3，8.4 苯佐卡因 Y=-1.746×105+2.246×10w 0.9995 2 5，10，50 80，90，87 13，7.0，10.0 咖啡因 Y=-4.869×10++6.045×10w 0.9970 2 5，10，50 93， 83， 92 8.8，11，7.3 利眠宁 Y=1.508×105+2.229×10w 0.9993 2 5，10，50 92，89，89 9.1，12，11 氯氮平 Y=4.678×106+2.880×10w 0.9937 5，10，50 81，68，73 9.2，5.8，1.3 可待因 Y=9.923×105+5.487×10w 0.9893 2 5，10，50 83，84，85 4.9，7.3，6.2 四氢大麻酚 Y= -3.232×104+2.116×10+w 0.9980 2 5，10，50 79，69，74 4.4，7.2，13 安宁 Y=3.443×10+1.048×10°w 0.991 5，10，50 84，63，71 7.4，13，9.9 地芬诺酯 Y= -7.532×105+2.764×10w 0.9939 5，10，50 77，64，64 9.3，8.1，9.7 舒乐安定 Y=3.223×10°+2.624×10°w 0.9948 5，10，50 99，94，，82 9.6，6.9，7.3 海洛因 Y=2.512×10°+3.610×10°w 0.9974 2 5，10，50 92，89，90 9.2，5.2，13 氯胺酮 Y=1.263×10+1.582×10°w 0.9930 5，10，50 90，87，82 6.6，7.7，9.3 劳拉西泮 Y=1.224×106+1.898×10w 0.9915 2 5，10，50 84，84，10* 12，7.5，13 3，4-亚甲二氧甲基苯丙胺 Y= 3.495×10+3.071×10w 0.9920 2 5，10，50 84，87，81 8.3，12，11 3，4-亚甲基二氧基苯丙胺 Y= 2.914×10+8.720×10+w 0.9771 2 5，10，50 86，92，87 7.0，9.3，7.1 杜冷丁 Y = 3.936×10+1.141×10'w 0.9854 5，10，50 78，82，80 6.1，8.0，5.8 美沙酮 Y=1.835×10+3.445×10°w 0.9905 5，10，50 79，69，75 11，12，9.0 咪哒唑仑 Y=4.569×10°+2.090×10°w 0.9856 5，10，50 82，73，94 8.3，9.1，9.1 吗啡 Y=-2.182×10+3.677×10+w 0.9983 2 5，10，50 78，75，74 10， 13，7.4 那可汀 Y=2.928×10+3.660×10°w 0.9973 5，10，50 67，70，67 9.4，7.1，11 去甲羟基安定 Y=4.838×10+1.882×10w 0.9836 5，10，50 79，82，78 11，9.3， 12 苯巴比妥 Y=-1.601×10+2.228×10°w 0.9912 5，10，50 85，81，82 9.6，6.3，8.0 蒂巴因 Y=2.957×10°+2.310×10w 0.9984 2 5，10，50 67，80，80 12，12，13 1三唑仑 Y=7.058×105+1.610×10°w 0.9988 5，10，50 87，79，87 7.4，12，8.7 2.6 回收率和精密度 分别在5、10、50 ug/kg3 个质量分数下进行空白样品加标回收试验，每个浓度水平重复6次，测定平均回收率及精密度结果见表2。在5~50 pg/kg浓度范围内，26种常见毒品的回收率在63%~104%之间，相对标准偏差为1.3%~14%，均符合残留测的要求。空白血液样品添加10 ug/kg。 2.7 样品测定 本方法已应用于连云港出入境检验检疫局出入境人员毒品检测阳性结果的确认。2010年全年对144名赴俄罗斯人员进行了毒品检测，按俄方要求检测甲基苯丙胺和吗啡，方法为胶体金免疫层析法和本方法。用胶体金免疫层析法发现疑似吗啡1例，用本方法进行确证，确证结果显示，吗啡的血药质量分数为28ug/kg。经调查该出国劳务人员 在休检前服用了某公司的止咳药(复方磷酸可待因)，由于该药含有可待因，而可待因代谢后产生吗啡。停止服用该药2d后，用这两个方法检测结果为阴性。证明本方法准确可靠。 ( 参考文献 ) ( 1] 马虹英，徐平声，蔡良音.中国药学杂志，2004， 39(6) ： 457 ) ( 张小婷，刘 娟，杜晖玲.刑 事 技术，2008，6：11 ) ( 王燕燕，孟品佳.应用 化 学，2009，26(12)：1495 ) ( 金永春，蔡明招，黄晓兰，等.分析测试学报， 2007， 2 6(2)：151 ) ( 5] 孟品佳，孙毓庆， 姜 兆兆.分析测试学报，1999， 18 ( 1)：17 ) ( [6] 向 平，卓先义，沈保保.中国法医学杂志，2006， 21(3) ：1 49 ) ( Determination of common abused drugs i n human blood by HPLC-MS/MS ) ZHANG Rui'， WANG Hai-tao*2， WU Bin'， YAO Yan-lin’， TAO Hong jin'， DING Yong jian'， DUAN Hong-an’， LIU Jian， XU Cong-lin’ and XU Wen-ke(1. Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Nanjing 210001；2. Lianyungang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Lianyungang 222042)， FenxiShiyanshi，2011，30(10)：71~74 Abstract： A rapid analytical method based on high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS) for detection of 26 abused drugs such as opioids，amphetamines and cocaines in human bloodwas developed. The linear ranges of 26 abused drugs were 2~200 ug/kg. In the range of 5 ~50 ug/kg， theaverage recoveries of 26 abused drugs were 63%~104%， and the limits of detection were 1~2 pg/kg..1Themethod was in accordance with the requirements for simultaneous determination of 26 abused drugs in humanblood. Keywords： High performance liquid chromatography tandem mass spectrometry； Blood determination； Abuseddrugs； Human blood — — 对人血液中鸦片类、苯丙胺类、可卡因类等26 种毒品的提取方法、净化方法、色谱条件及质谱条件进行了研究，建立了液相色谱-串联质谱法检测人血液中26 种常见毒品的检测方法。方法检测限为1 ～ 2 μg /kg。在2 ～ 200 μg /kg范围内，相关系数为0. 9771 ～ 0. 9995。在5 ～ 50 μg /kg 范围内，26 种常见毒品的回收率在63% ～ 104%之间，相对标准偏差为1. 3% ～ 14%。方法能够满足日常快速检测工作要求。