人iPS细胞中未分化性评价检测方案(液质联用仪)

Applicationn NNo.C209News http：//www.shimadzu.com.cn用户服务热线电话： 800-810-0439第一版发行日：2020年1月400-650-0439 ApplicationNews LC-MS 使用细胞培养基平台 C2MAPTM进行人 iPS细胞未分化性评价 No.C209 K. Toyoda， H. Kuroda， T. Suzuki 关键词： iPS细胞、代谢组学、非侵袭性评价方法 主旨 使用细胞培养基平台C2MAP进行人 iPS 细胞的培养上清液分析，鉴定了未分化/分化状态的标志物成分。通过对鉴定的沐志物成分进行监控，表明对细胞状态进行非侵袭性评价的可能性。 实验方法 使用 TeSR-E8 对人 iPS 细胞进行了6天未分化维持培养。为了搜索未分化/分化状态的特征性标志物候选成分，按照表1所述的培养条件添加了细胞因子、低分子化合物等的液性因子，对各胚层系施加了分化诱导刺激。每隔24小时对各培养系进行培养基全量更换，回收已用的培养上清液，作为测定样品。 将回收的培养上清液放入C2MAP 中，对表2所述的95种成分进行同时分析。 然后，分别使用 C2MAP TRENDS 和多组学分析软件包进行数据分析，探索样品间存在明显差异的成分。 表1培养条件 细胞株 人iPS细胞(PFX#9株) 培养基 TeSR-E8TM 支架材料 Vitronectin-NTM 初期播种量 1 × 10cell/well 样品板种类 6well plate 培养上清液样品及数据由公益财团法人神户医疗产业都市推进机构川真田先生提供。 No.化合物名称 分类 No. 化合物名称 分类 No. 化合物名称 分类 IS ： 2-Isopropylmalic acid 对照物质 32 N-Acetylaspartic acid 氨基酸 64 Cytidine 核酸相关 1 Gluconic acid 糖 33 N-Acetylcysteine 氨基酸 65 Cytidine monophosphate 核酸相关 2 Glucosamine 糖 34 Ornithine 氨基酸 66 Deoxycytidine 核酸相关 3 Hexose (Glucose) 糖 35 Oxidized glutathione 氨基酸 67 Guanine 核酸相关 4 Sucrose 糖 36 Phenylalanine 氨基酸 68 Guanosine 核酸相关 5 Threonic acid 糖 37 Pipecolic acid 氨基酸 69 Guanosine monophosphate 核酸相关 6 2-Aminoadipic acid 氨基酸 38 Proline 氨基酸 70 Hypoxanthine 核酸相关 7 4-Aminobutyric acid 氨基酸 39 Serine 氨基酸 71 Inosine 核酸相关 8 4-Hydroxyproline 氨基酸 40 Threonine 氨基酸 72 Thymidine 核酸相关 9 5-Glutamylcysteine 氨基酸 41 Tryptophan 氨基酸 73 Thymine 核酸相关 10 5-Oxoproline 氨基酸 42 Tyrosine 氨基酸 74 Uracil 核酸相关 11 Alanine 氨基酸 43 Valine 氨基酸 75 Uric acid 核酸相关 12 Alanyl-glutamine 氨基酸 44 4-Aminobenzoic acid 维生素 76 Uridine 核酸相关 13 Arginine 氨基酸 45 Ascorbic acid 维生素 77 Xanthine 核酸相关 14 Asparagine 氨基酸 46 Ascorbic acid 2-phosphate 维生素 78 Xanthosine 核酸相关 15 Aspartic acid 氨基酸 47 Biotin 维生素 79 Penicillin G 抗生素 16 Citrulline 氨基酸 48 Choline 维生素 80 2-Aminoethanol 其他 17 Cystathionine 氨基酸 49 Cyanocobalamin 维生素 81 2-Ketoisovaleric acid 其他 18 Cysteine 氨基酸 50 Ergocalciferol 维生素 82 3-Methyl-2-oxovaleric acid 其他 19 Cystine 氨基酸 51 Folic acid 维生素 83 4-Hydroxyphenyllactic acid 其他 20 Glutamic acid 氨基酸 52 Folinic acid 维生素 84 Citric acid 其他 21 Glutamine 氨基酸 53 Lipoic acid 维生素 85 Ethylenediamine 其他 22 Glutathione 氨基酸 54 Niacinamide 维生素 86 Fumaric acid 其他 23 Glycine 氨基酸 55 Nicotinic acid 维生素 87 Glyceric acid 其他 24 Glycyl-glutamine 氨基酸 56 Pantothenic acid 维生素 88 Histamine 其他 25 Histidine 氨基酸 57 Pyridoxal 维生素 89 Isocitric acid 其他 26 Isoleucine 氨基酸 58 Pyridoxine 维生素 90 Lactic acid 其他 27 Kynurenine 氨基酸 59 Riboflavin 维生素 未分化 vs外胚层 未分化vs 内胚层 未分化 vs中胚层 51 51 Up 5- 4- 4 Down 4- 3- 3 3- Kynur：nine 2-Aminoadipic acid Kynurenine 2- 21 2- Kynurenine 1- 1 1- 0- 01 01 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 -3.0 -2.5 -2.0 -1.5-1.0 -0.5 0.0 0.5Log2(Foldchange)图 1 Volcano PlotKynurenine0.8 -2.0 -1.5 -10 -0.5 00 0.5 1.0 1.5 Log2(Foldchange) Log2(Foldchange) Tryptophan 2-aminoadipic acid 0.25 1.5 0.2 0.6 0.15 0.4 0.1 0.5 0.2 0.05 0 一王 天 天 0 天 Undifferentiated Endoderm Mesoderm Ectoderm |结果 <培养上清液中的标志物候选成分探索> 通过 C2MAP 进行培养上清液的多成分同时分析后，在95种成分中，检测到了55种成分。培养开始后，为了探索可以早期判定分化状态的标志物成分，将培养第3天的各成分面积比提供给Volcano Plot， 对未分化 iPS 细胞和在各胚层系中进行分化诱导的 iPS细胞进行了组间比较(图1)。结果发现，在未分化 iPS 细胞的培养上清液中明显检测到具有特异性的Kynurenine。另外，在外胚层分化细胞的培养上清液中明显检 表3 Day4 的浓度值 化合物名称 浓度值(外标法) 浓度值(加标法) Kynurenine 0.22 uM 0.23 uM 2-Aminoadipic acid 0.25 uM 0.19 uM Tryptophan 0.90 uM 1.05 uM ※Kynurenine.Tryptophan 是未分化维持培养样品的测定值， 2-Aminoadipicacid 是外胚层分化样品的测定值 测到了具有特异性的 2-Aminoadipic acid。 关于包含上述化合物在内的两组间发现差异的成分，使用外标法进行定量，对与培养过程相关的时效变化绘制了图表(图2)。从结果来看，在未分化 iPS 细胞的培养上清液中， Tryptophan 随着培养过程而被消耗，其代谢产物 Kynurenine 的分泌量增加。另外，在外胚层分化细胞的培养上清液中， 2-Aminoadipic acid 的浓度随着培养过程而增加。另外，在通过加标法得到的数据中，时效变化的形态和图2一样，因此，证实所得到的图表体现了培养上清液的实际浓度变化情况。 为了调查作为未分化标志物候选成分而鉴定出的 Kynurenine 的作用，我们着眼于 Kynurenine 的代谢系统。通过在培养基中添加从Tryptophan 代谢为 Kynurenine 的代谢酶ID01的抑制剂，进行未分化维持培养，证明细胞增殖得到了抑制(图3)。另外，通过培养上清液分析结果，证实了通过添加ID01抑制剂，可以抑制 Kynurenine 的生成(图4)。因此，这表明 Kynurenine 在未分化 iPS 细胞的增殖中起到了非常重要的作用。 4.93E+4 图3显微镜图像 现在已知，Kynurenine 与芳香烃受体(AHR)结合，形成复合体 (Kyn-AHR)，被输送到核内后，使部分基因表达上升。为了调查 Kyn-AHR复合体在未分化 iPS 细胞中的作用，将 AHR 拮抗剂添加到培养基中，进行了未分化维持培养。结果证实，通过添加 AHR拮抗剂，细胞增包得到抑制(图5)， Kynurenine 的生成得到抑制(图6)。另外，通过染色质免疫沉淀一定量 PCR 法证实了 Kyn-AHR 复合体可以使维持未分化、与自我复制相关的转录因子 (POU5F1、NANOG、EP300)以及AHR、ID01 的表达量上升。 8.00E+4 图5显微镜图像 图6 Tryptophan、Kynurenine 与培养过程相关的时效变化 <2-Aminoadipic acid 在外胚层分化细胞中的代谢系统> 关于作为外胚层分化标志物候选成分而鉴定出的2-Aminoadipic acid，我们也着眼于代谢系统，对其作用进行了调查。2-Aminoadipic acid 的生成路径应为 Lysine 的代谢和 Kynurenine 代谢的两种路径。与未分化 iPS 细胞与外胚层分化细胞的比较中，Lysine的消耗未发现与时效变化相关的差异(图7)，因此，推测 2-Aminoadipic acid 主要由 Kynurenine 的代谢路径生成。 在培养基中添加KAT2(上述代谢酶组之一)的抑制剂，施加外胚层分化诱导刺激。结果观察到通过添加KAT2 抑制剂，2-Aminoadipicacid 的生成得到了抑制(图7)，对外胚层的分化在一定程度上得到了抑制(图8)。因此，这表明通过分化诱导刺激，对维持未分化起到重要作用的 Kynurenine的分解路径活性增强，随着 Kynurenine 的分解而生成了2-Aminoadipic acid. 图7 Lysine、2-Aminoadipic acid 与培养过程相关的时效变化 图8基因表达分析结果 <维持未分化和开始诱导分化的作用机制> 综合以上得到的结果，在未分化 iPS细胞中， 由 Tryptophan 生成的Kynurenine通过在细胞质中与AHR结合，形成 Kyn-AHR复合体。Kyn-AHR复合体转移至核内，使维持未分化和与自我复制相关的转录因子的表达量上升。同时， Kyn-AHR复合体通过使AHR、ID01的表达量上升，让上述路径更加稳固，维持未分化状态。另外，剩余的 Kynurenine 在培养液中被分泌，通过 Kynurenine 持续保持未分化维持环的活性。另一方面，在施加外胚层诱导刺激后，包括 KAT2 在内的与 Kynurenine 相关的酶组表达量上升，细胞中的Kynurenine 被代谢，生成 2-Aminoadipic acid。 由于 Kynurenine 浓度下降，通过 Kynurenine 保持的未分化维持环不再发生作用，从未分化状态开始向外胚层进行分化诱导(图9)。 图9 Kynurenine、2-Aminoadipic acid 的代谢路径与基因表达的相关图 1结论 通过使用 C2MAP 对培养上清液的多种成分进行同时分析，分别鉴定出了 Kynurenine、2-Aminoadipic acid， 作为在未分化 iPS 细胞、外胚层分化细胞中表示特征性波动的标志物成分。结果表明，所鉴定出的标志物成分是与细胞的未分化/外胚层分化状态密切相关的因子。因此，通过使用本系统，可以对细胞状态进行非侵袭性的评价。 ( 参考文献 ) ( 1)T. Yamamoto， K. H a tabayashi， M. Ar i ta， N. Y a jima， C. Takenaka， T. Su zuki， M. T a kahashi， Y. O s hima， K. Hara， K. K a gawa， S.Kawamata ： Kynu r enine signa l ingthrough the aryl hydrocarbon receptor maintains the undifferentiated state of human e m bryonic stem cells， Sci . Signal. 1 2， eaaw3306 (2019). ) 岛津应用云 依据医药产品医疗器械法，本文件中所述的产品未获得作为医疗器械的批准。不能用于治疗诊断目的及其手续。 岛津企业管理(中国)有限公司岛津(香港)有限公司 ( 免责声明： ) ( *本资料未经许可不得擅自修改、转载、销售； ) ( *本资料中的所有信息仅供参考，不予任何保证。如有变动，恕不另行通知。 ) 为了实现再生医疗的产业化，需要开展可以高品质、大量制备和供应细胞的技术开发工作。过去，对细胞状态进行评价的方法主要采用基因表达分析的方法，但是，上述方法具有细胞侵袭性，因此，一般作为培养结束后的评价方法使用。我们为了确立通过分析细胞培养上清液的成分对细胞状态进行非侵袭性评价的方法，开发了使用液相色谱-质谱联用分析仪（LC-MS/MS）的细胞培养基分析平台C2MAP。