蛋白中Biochrom30+氨基酸分析仪蛋白水解图谱优化检测方案(氨基酸分析仪)

DKSH Biochrom30+氨基酸分析仪蛋白水解图谱优化 -、标样配置 氨基酸混合标准储备液：含有天冬氨酸、苏氨酸等17种常见组成蛋白质的氨基酸。 17 种氨基酸标准品 行号 氨基酸 行号 氨基酸 1 Asp 天冬氨酸 2 Thr 苏氨酸 3 Ser 丝氨酸 4 Glu 谷氨酸 5 Pro 脯氨酸 6 Gly 甘氨酸 7 Ala 丙氨酸 8 Cys 胱氨酸 9 Val 缬氨酸 10 Met 蛋氨酸 11 lle 异亮氨酸 12 Leu 亮氨酸 13 Tyr 酪氨酸 14 Phe 苯丙氨酸 15 His 组氨酸 16 Lys 赖氨酸 17 Arg 精氨酸 18 二、分析方法描述(Biochrom 30+) 1)1色谱柱： Biochrom Na 型阳离子交换树脂柱， 4.6x20cm 2)运行时间：常规分析时间+再生时间 56min 3)反应单元温度：135℃。 4)分离程序： NO. Time Temp Buffer Pump Nin Rec Commands 1 01：00 48 1 35.0ml/h ON OFF 2 00：00 48 1 35.0ml/h ON OFF Reset 3 01：00 48 1 35.0ml/h (ON OFF Load 4 06：40 48 1 35.0ml/h ON ON 5 13：00 52 2 35.0ml/h ON ON 6 01：00 52 5 35.0ml/h (ON ON 7 16：00 95 5 35.0ml/h ON ON 8 04：00 95 6 35.0ml/h ON ON 9 04：00 95 1 35.0ml/h (ON ON 10 09：00 48 1 43.0ml/h (OFF OFF 11 02：00 48 1 35.0ml/h ON OFF End 三、蛋白水解图谱优化 四、蛋白水解图谱优化原理及方法 Biochrom 30+系列提供的蛋白质水解产物程序可能需要稍做改动以达到在蛋白水解产物标准中的最佳氨基酸分离，影响氨基酸分离的因素是： 缓冲液和有机溶剂的 pH 值和克分子浓度 缓冲液时间 分析柱温度 缓冲液流速 树脂床长度 下列优化讨论和步骤是用于 Biochrom 30+系列氨基酸分析系统使用 Biochrom 生产或一些常用缓冲液配方的： 缓冲液 pH 值和克分子浓度 (The pH and Molarity of the buffers) 在离子交换层析中，使用不同 pH 和克分子浓度的缓冲液是能分离氨基酸的。 -般来说，pH或克分子浓度越高，氨基酸洗脱的越快。 为做蛋白质水解产物氨基酸层析，有三种缓冲液和一种再生溶液(0.04M 氢氧化钠)被用在分步洗脱程序中： 第一种缓冲液， pH3.20， 0.20M，l， 洗脱氨基酸 Asp， Thr， Ser， Glu， Pro， Gly 和 Ala 而 Cys要到第一和第二缓冲液梯度上洗脱。 第二种缓冲液洗脱的氨基酸 Val， Met， lle， Leu 和 Nleu。当样品中存在氨基糖时，第二种缓冲液 pH4.25， 0.2M 的时间要延长以洗脱 Tyr 和 Phe。 第三种缓冲液， pH6.45， 0.2M 洗脱氨基酸 His， Lys， Amm 和Arg. 缓冲液时间 (Time of the buffers) pH3.20 缓冲液的时间将影响 Ala/Cys/Val 的分离。pH3.20 缓冲液时间较长就会延迟 Cys接近 Val，，时间较短就会较早洗脱 Cys 并接近 Ala。 pH3.20缓冲液的最佳时间为在 Ala和 Val 中间洗脱 Cys。精细调节pH3.20缓冲液时间可能会象要求的那样增加或减少0.25到0.50分钟。当样品中含有氨基糖时，第二种 pH4.25， 0.2M 的缓冲液被调节到洗脱出Nleu 或 Phe。最后的 pH6.45， 1.20M的缓冲液要延长到在此缓冲液上洗出 Arg。 柱温度 (Column Temperature) 蛋白水解产物层析由编程下列三种温度范围实现： T1：这是平衡后和注入前及注入后约5分钟的分析柱的温度，这种温度范围影响Thr/Ser 及 Glu/Pro 的分离并影响分析柱的反压。一般来说，初次温度越低，， Thr/Ser分离得越好，而 Glu/Pro的分离变坏并且柱反压增加。理想的T1是低范围的(40-50℃)其给出 Glu/Pro 基线分离且具有能接受的柱反压(<80巴)。在第一种缓冲液中额外加入IPA (0.5%-1.0%) 能改善 Thr/Ser 的分离状况。注意，第一种 pH3.20缓冲液已含有 2%IPA， 更多的 IPA将增加柱的反压并且可能劣化 Gly/Ala 的分离状况。 T2：这个温度范围将影响 ille/Leu 和 Tyr/Phe的分离。低T2范围改善 lle/Leu 分离，而高T2范围改善 Tyr/Phe 分离。一种折衷的解法是保持 T2温度范围足够低(50-60℃)使80% lle/Leu 完成分离并提早将 T2变到 T3(在 lle的保留时间(RT)前5分钟)以实现分离好 Tyr/Phe。 T3：该温度范围(≥90℃)用来改善 His/Lys 的分离和加速层析。 蛋白质水解产物最佳分离提要 Thr/Ser： 除去柱头间隙 降低的 T1 在pH3.20缓冲液中额外外入0.5%到1.0%IPA Glu/Pro： 提高T1 Gly/Ala： 增加平衡时间 在 pH3.20缓冲液中减少有机溶剂 Ala/Cys： 增加 pH3.20缓冲液时间Cys/Val： 减少 PH3.20缓冲液时间lle/Leu： 降低T2范围 在 lle 的保留时间前推迟T2到T3的改变时间约5分 Tyr/Phe： 较早引入 T3 提高T3范围 His/Lys： 提高T3范围 较早引入T3 更多内容，关注“大昌华嘉科学仪器部”微信公众号 选择大昌华嘉，就是选择仪器应用专家Think Asia. Think DKSH.www.dksh-instrument.cn 电话： 邮箱： ins.cn@dksh.com Biochrom30+氨基酸分析仪蛋白水解图谱优化,一、标样配置氨基酸混合标准储备液：含有天冬氨酸、苏氨酸等17种常见组成蛋白质的氨基酸。