水果、蔬菜中维生素K1的测定检测方案(固相萃取仪)

食品中维生素K1的测定(GB 5009.158-2016) 适用范围及原理 水果、蔬菜等低脂性植物样品,用异丙醇和正己烷提取其中的维生素 K1,经维生素K1前处理小柱净化,去除叶绿素等干扰物质。用 C18 液相色谱柱将维生素K1 与其他杂质分离,锌柱柱后还原,荧光检测器检测,外标法定量。（本实验选用菠菜和苹果） 参考标准：《GB 5009.158-2016 食品安全国家标准 食品中维生素K1的测定》 溶液的配置 维生素K1标准贮备溶液(1mg/mL):精确称取 50mg(精确至0.1mg)维生素K1标准品于50mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度。将溶液转移至棕色玻璃容器中。在-20℃下避光保存,保存期2个月。 维生素K1标准中间液(100μg/mL):准确吸取标准贮备溶液10.00m于100mL容量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀。将溶液转移至棕色玻璃容器中,在-20℃下避光保存,保存期2个月 维生素K1标准使用液(1.00μg/mL):准确吸取标准中间液1.00mL于100mL容量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀。 正己烷-乙酸乙酯混合液( 90+10 ):量取 90mL正己烷,加入 10mL 乙酸乙酯,混匀 流动相:量取甲醇 900mL ,四氢呋喃 100mL ,冰乙酸 0.3mL ,混匀后,加入氯化锌 1.5g ,无水乙 酸钠 0.5g ,超声溶解后,用 0.22 μ m 有机系滤膜过滤。 提取步骤 精确称取5g经均质匀浆的样品于50mL离心管中，加入5mL异丙醇，旋涡1min，超声5min，再加入10mL正己烷，旋涡震荡提取3min，6000r/min离心5min，移取上清液至25mL棕色容量瓶中，向下层溶液中加入10mL正己烷，重复提取1次，合并上清液于上述容量瓶中，正己烷定容至刻度。用移液管准确移取上清液5mL至15mL离心管中，氮气轻吹至干，加入1mL正己烷溶解，待净化。 SPE净化步骤 SPE柱：月旭Welchrom®维生素K1前处理小柱，规格：2g/6mL。 活化：5mL正己烷，弃去 上样：待净化液全部上样，弃去 淋洗：5mL正己烷淋洗，弃去 洗脱：15mL正己烷-乙酸乙酯混合液洗脱，收集于50mL离心管中，抽干 氮吹至近干,用甲醇定容至5mL，并过0.22 µm滤膜，上HPLC检测。 注意事项 上样速度不能过快，保持在1s/滴，整个过程填料保持湿润 最终洗脱，标准中的6mL，洗脱不是很完全，此处增加到15mL 加标水平：苹果样品加标为5g样中加入0.25mL 1mg/L标品，加标水平为0.05μg/g，机读数为10ng/mL。菠菜样品加标为5g样中加入0.05mL 100mg/L标品，加标水平为1μg/g，机读数为200ng/mL（因苹果和菠菜本身基质中就含有维生素K1，此处加标是按照基质中含维生素K1的量进行加标的） 前处理过程尽量避光 色谱条件 色谱柱：月旭Ultimate® XB-C18 4.6×250mm,5μm 月旭 Ultimate® Zn 4.6×50mm 流动相：甲醇 900mL ,四氢呋喃 100mL ,冰乙酸 0.3mL ,混匀后,加入氯化锌 1.5g ,无水乙 酸钠 0.5g 流速：1.0mL/min 柱温：30℃ 进样量：10μL 检测波长：激发波长为243nm，发射波长为430nm 7、色谱图或者加标回收率结果 图1.维生素K1对照10ng/mL 峰号 保留时间 面积 高度 理论塔板数 拖尾因子 1 15.160 163812 8730 15116 0.952 图2.维生素K1对照200ng/mL 图3.苹果原样 图4.苹果样+标0.05μg/g 图5.菠菜原样 图6.菠菜样+标1μg/g 表1：加标回收率 名称 基质 原样峰面积 对照品峰面积 样加标峰面积 加标水平μg/g 回收率% RSD% N=3 维生素K1 苹果 119239 163812 （10ng/mL） 253349 0.05μg/g 82 3.86 251519 81 261381 87 菠菜 4540233 2657936 （200ng/mL） 6764112 1μg/g 84 3.50 6887698 88 6919257 90 8、相关产品信息 货号 名称 规格 00573-20036 Welchrom®维生素K1专用柱 2g/6ml,30pk 00837-05006 50ml一次性离心管 平盖，锥形底,RCF12000xg,袋装,未灭菌，50ml，50/包 00837-05002 15ml一次性离心管 平盖，锥形底,RCF12000xg,袋装,未灭菌，15ml，50/包 00824-31001 Welch 固相萃取装置 12位方缸 00822-00007 样品瓶套装 2ml 透明短螺纹广口样品瓶（带手写处），预切口白色特氟龙/红色硅胶隔垫，9mm蓝色短螺纹开口盖 中心孔6mm 100pk 00201-31041 Ultimate XB-C18分析柱 Ultimate XB-C18, 5μm, 4.6*150mm 00225-51037 Ultimate Zn分析柱 Ultimate Zn, 4.6*50mm 00826-V030P100 维生素K1标准品 CAS No.:84-80-0,100mg 声明:除非另有说明，此报告结果仅对该测试样品负责。本报告未经公司许可，不可复制。 Add:浙江省金华市婺城区双林南街168号 Tel:400-810-6969 邮编：321000 E-mail:lingyuyu@welchmat.com No.1 适用范围及原理水果、蔬菜等低脂性植物样品,用异丙醇和正己烷提取其中的维生素 K1,经维生素K1前处理小柱净化,去除叶绿素等干扰物质。用 C18 液相色谱柱将维生素K1 与其他杂质分离,锌柱柱后还原,荧光检测器检测,外标法定量。（本实验选用菠菜和苹果） 参考标准：《GB 5009.158-2016 食品安全国家标准 食品中维生素K1的测定》 No.2 SPE净化步骤SPE柱：月旭Welchrom®维生素K1前处理小柱；规格：2g/6mL；活化：5mL正己烷，弃去；上样：待净化液全部上样，弃去；淋洗：5mL正己烷淋洗，弃去；洗脱：15mL正己烷-乙酸乙酯混合液洗脱，收集于50mL离心管中，抽干；氮吹至近干,用甲醇定容至5mL，并过0.22 µm滤膜，上HPLC检测。 No.3 色谱条件色谱柱：月旭Ultimate® XB-C18  4.6×250mm,5μm；月旭 Ultimate® Zn 4.6×50mm；流动相：甲醇900mL，si氢呋喃100mL，冰乙酸0.3mL，混匀后,加入氯化锌1.5g，无水乙酸钠0.5g；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL；检测波长：激发波长为243nm，发射波长为430nm。 No.4 色谱图或加标回收率结果No.5 相关产品信息