人血清中氟康唑的含量检测方案(液质联用仪)

SSL-CA14-992Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-389 岛津企业管理(中国)有限公司分析中心Shimadzu(China)CO.，LTD. Analytical Applications Centerhttp：//www.shimadzu.com.cn上海市徐汇区宜州路180号华鑫天地二期C801栋咨询电话：021-34193996Hotline：021-34193996Building C801，No.180 Yizhou Road， Shanghai CLAM-2000-LCMS-8050CL联用系统测定人血清中8种抗真菌药的含量 LCMSMS-389 摘要：本文利用岛津在线自动前处理仪 CLAM-2000 及岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱仪LCMS-8050CL联用对血清中8种抗真菌药进行定性定量分析。此方法使用岛津在线自动前处理仪 CLAM-2000处理血清样品，内标法定量，每个样品从在线自动前处理到液质分析完成仅需 4 min。血清样品使用试剂盒提供的试剂除蛋白后，离心，移取上清液，进样分析。采用电喷雾离子源正离子模式， MRM模式采集数据，内标法定量。结果显示，在各自的线性范围内，氟胞嘧啶等8种抗真菌药及代谢物的线性良好，线性相关系数>0.999。低、高两个浓度的质控样品定值结果与标示浓度的偏倚位于85%~115%之间，在允许范围内。同时，进行了重复性实验，保留时间的 RSD≤0.33%，浓度的RSD≤6.43%。该方法可用于临床样本的快速、准确定量。 近年来，真菌感染的发生概率大幅上升，其主要原因是接受器官移植、免疫抑制疗法以及滥用药物导致的。由于实际临床需求增加，抗真菌药物品种有了很大的发展，但是真菌感染的发病率与死亡率仍然很高，临床上抗真菌药物的选择与疗法主要由医生经验决定。体内药物浓度必须达到治疗浓度并维持用药才能起效，因此抗真菌药物的血清浓度监测被证明对于治疗真菌感染的给药方案优化甚至预防真菌感染都是最有效的方法之一。常用的抗真菌药物主要分为多烯类、吡咯类、棘白菌素类以及氟胞嘧啶等。吡咯类的药物，如伏立康唑、泊沙康唑、伊曲康唑以及代谢物羟基伊曲康唑，由于其广谱抗菌性，广泛用于真菌 治疗的感染。吡咯类抗菌药主要通过抑制一种或多种CYP 酶活性来治疗真菌性感染。棘白菌素类抗菌药毒副作用较小，临床上主要与其他类抗真菌药联合使用。由于药代动力学特征、副作用、药物相互作用和药物基因组学显著差异，抗真菌药在治疗过程中血药浓度个体差异很大，因此需要对特定的药物进行血药浓度监测，保证用药安全有效。 本文利用岛津在线自动前处理仪 CLAM-2000及岛津超高效液相色谱仪和三重四极杆质谱仪LCMS-8050CL联用对血清中8种抗真菌药进行定性定量分析。有助于高通量、更简单、更安全、更准确地实现临床研究中复杂重复的工作流程。 |实验部分 1.1仪器 岛津 CLAM-2000-LCMS-8050联用系统(见图1)。具体配置为：在线自动前处理仪 CLAM-2000， CLAM-2000 Ver. 1.13在线自动前处理仪工作站，LC-30A×2输液泵，DGU-20A5R 在线脱气机， SIL-30AC自动进样器，CTO-20AC 柱温箱， CBM-20A系统控制器， LCMS-8050CL三重四匹杆质谱仪配ESI离子源， LabSolutionsVer. 5.91色谱工作站。 图1岛津CLAM-2000-LCMS-8050 CL联用系统 1.2分析条件 液相条件： 流动相：A相-0.1%乙酸+5mM乙酸铵水溶液；B相-乙腈 流速：0.4mL/min 色谱柱： Shim-pack GIST 2.1 mm l.D. ×50 mm L.， 2.0 um柱温：40℃ 进样体积：2uL (Co-injection， 纯水=10uL) 洗脱方式：梯度洗脱，见表1 表1梯度洗脱条件 时间 单元 处理命令 值 0.30 泵 B.Conc 5 0.40 泵 B.Conc 40 1.50 泵 B.Conc 95 2.00 泵 B.Conc 95 2.10 泵 B.Conc 5 3.50 控制器 Stop 质谱条件： 离子源：ESI*加热气流量：10.0 L/minDL管温度：250℃扫描模式：MRM模式，见表2 接口电压：4.5 KV 雾 化气：3.0L/min 干燥气流量：10.0 L/min 接口温度：300℃ 加热块温度：400℃ 表 2MRM 参数 化合物 英文名 CAS No. 类型 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias CE (V) Q3 Pre Bias (V) (V) 氟胞嘧啶 2022-85-7 目标 130.0 58.0* -10 -37 -22 5-Fluorocytosine 130.0 112.9 -10 -23 -19 氟康唑 86386-73-4 目标 306.9 238.1* -22 -24 -12 Fluconazole 306.9 220.0 -22 -12 -12 羟基伊曲康 Hydroxy- 112559-91-8 目标 721.1 408.2* -28 -39 -27 唑 ltraconazole 721.1 392.2 -22 -36 -26 438.2 224.0* -21 -8 -13 艾莎康唑 241479-67-4 目标 Isavuconazole 438.2 369.0 -21 -12 -15 伊曲康唑 Itraconazole 84625-61-6 目标 705.1 392.2* -22 -38 -26 705.1 432.2 -22 -34 -29 酮康唑 Ketoconazole 65277-42-1 目标 531.2 489.3* -10 -25 -13 531.2 244.2 -13 -30 -10 泊沙康唑 Posaconazole 171228-49-2 目标 701.2 614.3* -22 -36 -28 701.2 344.2 -22 -47 -22 伏立康唑 Voriconazole 137234-62-9 目标 350.2 281.2* -29 -8 -11 350.2 127.2 -29 -12 -11 c，15N-氟胞嘧啶 13C，15N2-5- Fluorocytosine 1216616-31-7 内标 133.1 115.0 -10 -23 -19 d4-氟康唑 d4-Fluconazole 1124197-58-5 内标 310.9 242.1 -22 -24 -12 d5-羟基伊曲唑 d5-Hydroxy- Itraconazole 1217524-77-0 内标 726.2 413.2 -28 -39 -27 c，d4-艾莎康唑 13C，d4-Isavuconazole 内标 443.0 224.0 -21 -8 -13 d5-伊曲康唑 d5-Itraconazole 84625-61-6 内标 710.2 397.2 -22 -38 -26 d8-酮康唑 d8-Ketoconazole 1217706-96-1 内标 539.3 497.3 -10 -25 -13 d4-泊沙康唑 d4-Posaconazole 1133712-26-1 内标 705.3 618.3 -22 -36 -28 d3-伏立康唑 d3-Voriconazole 1217661-14-7 内标 353.2 284.2 -29 -8 -11 *定量离子对 1.3基质标准品、质控品及样品制备 参考德国RECIPE《血清/血浆中抗真菌药试剂盒使用指南》，进行样品制备。 该试剂盒包含以下部分： 基质标准品：3个水平的人血清基质加标冻干粉 质控品：2个水平的人血清基质加标冻干粉 内标：含c，15Nz-氟胞嘧啶、d4-氟康唑等8种同位素标记的内标的冻干粉 优化用混标：冻干粉 蛋白沉淀剂：50mL 样品释放剂：50mL 基质标准品(Level 0~Level 3) 和质控品 (Levell、Levelll)： 1.0mL纯水溶解，涡旋混匀15min。 内标工作液：准确加入5.0mL蛋白沉淀剂，混匀，超声15min。 优化用混标：加入2.0mL流动相B，混匀。 基质标准品、质控品和样品前处理方法： 在CLAM-2000工作站界面优化自动前处理参数、蛋白沉淀剂使用量、震摇转速、震摇时间、抽滤时间等。确定样品自动前处理程序具体操作为(1)、吸取15 uL甲醇活化化滤管，准备上样； (2)、吸取对照品、质控品或血清样品20 uL上样； (3)、吸取内标工作液沉淀剂 40 uL 至过滤管进行沉淀蛋白； (4)、转速2400 rpm震摇90秒； (5)、使用-50~-60 kPa的负压抽滤过滤管120s使溶液进入接收管； (6)、接收管转移至液相自动进样器，进样2uL。 I结果讨论 2.1基质标准品色谱图 岛津CLAM-2000-LCMS-8050 CL联用系统可以实现并行前处理，即在一个样品自动前处理时，系统会根据前处理程序，同时自动开始下一个样品的前处理，并可以多个样品同时处理(见图2)，大大缩短了前处理时间，若实验单个样品前处理时间为6min， 质谱分析时间为 5 min， 并行前处理功能使样品在线自动前处理与液质分析时间重叠，从在线自动前处理到液质分析完成仅需6 min， 大大节省分析时间，优化仪器的使用和样品通量。本实验样品前处理时间为 4 min，质谱分析时间为 3.5 min。 图2 CLAM-2000 并行前处理示意图 2.2基质标准品色谱图 图3基基标 Level1浓度色谱图 2.2基质标准品色谱图 试剂盒中各级别基质标品浓度和线性回归各浓度的准确度如表3所示，按1.3中的分析条件进行分析检测，利用内标法制作校准曲线。该线性范围包含了药物的正常血药浓度范围[1]。线性良好，线性方程、相关系数见图2。 表38种抗真菌药的校准曲线 化合物 基质标曲浓度 (ug/mL) 准确度(%) Level1 Level2 Level 3 5-Fluorocytosine 5.12 39.7 117 95.7-104.8 Fluconazole 0.564 4.14 12.6 99.0-100.9 Hydroxy-Itraconazole 0.164 1.19 3.6 98.0-101.8 Isavuconazole 0.482 3.49 10.6 97.6-102.1 Itraconazole 0.133 0.955 2.94 99.6-100.4 Ketoconazole 0.406 2.89 8.34 98.0-101.8 Posaconazole 0.232 1.68 5.01 98.1-101.7 Voriconazole 0.265 1.93 5.9 99.8-100.2 人校准曲线J光谱 人校准曲线J光谱 校准曲线J光错 图28种抗真菌药的线性方程及相关系数 2.4质控样品考察 按1.2中的分析条件和1.3中的前处理方法对试剂盒中的质控品 Levell和 Level Il 进行分析，标示浓度和允许波动范围如表4所示，实际检测浓度在允许波动范围内。 表4质控样品检测结果 化合物 标示浓度((ug/mL) 允许波动范围(ug/mL) 实测则度(pg/mL) Levell Level Il LevelI Level II Levell LevelIl 5-Fluorocytosine 21.7 50.9 17.40-26.10 40.70-61.10 22.40 50.20 Fluconazole 2.29 5.4 1.83-2.75 4.32-6.48 2.25 5.54 Hydroxy-Itraconazole 0.654 1.56 0.52-0.79 1.25-1.87 0.68 1.58 Isavuconazole 1.92 4.55 1.54-2.31 3.64-5.46 1.97 4.59 ltraconazole 0.528 1.26 0.42-0.63 1.01-1.51 0.61 1.28 Ketoconazole 1.63 3.68 1.30-1.96 2.94-4.41 1.58 3.45 Posaconazole 0.91 2.18 0.73-1.09 1.74-2.61 1.00 2.28 Voriconazole 1.07 2.53 0.85-1.28 2.03-3.04 1.01 2.45 2.5重复性考察 质控品Levell和 LevelII分别连续进行前处理进样分析6次，计算保留时间及浓度的相对标准偏差(RSD)。结果如表5所示，8种抗真菌药物保留时间及浓度 RSD 均处于合理范围。 表5重复性考察结果 化合物 保留时间 RSD (%) 浓度 RSD (%) Levell Level ll Levell LevelIl 5-Fluorocytosine 0.22 0.14 6.43 2.48 Fluconazole 0.33 0.27 3.43 2.07 Hydroxy-Itraconazole 0.25 0.19 3.05 1.12 Isavuconazole 0.24 0.18 2.29 1.13 Itraconazole 0.26 0.17 3.83 3.93 Ketoconazole 0.30 0.20 2.55 2.27 Posaconazole 0.28 0.19 4.03 4.10 Voriconazole 0.29 0.21 1.40 1.29 l结果与讨论 本文建立了一种利用岛津岛线自动前处理仪 CLAM-2000及岛津超高效液相色谱仪LC-30A 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8050CL联用对血清中8种抗真菌药进行定性定量分析的方法。此方法使用岛津在线自动前处理仪 CLAM-2000处理血清样品，内标法定量，线性相关系数>0.999。低、高浓度质控样品定值结果均在允许范围内，重复性实验保留时间的 RSD ≤0.33%，浓度的 RSD ≤6.43%。此联用系统能在线自动处理样品且数据重复性好，消除手动操作生物样品带来的风险，最大限度地减少操作人员与生物样本的接触，放入采血管、必要试剂和专用处理管，便可进行在线自动前处理，每个样品并行处理，以优化仪器的使用和样品通量，并且通过软件来管理试剂、校准曲线、控制样品和系统维护，确保系统的性能和可靠性，系统提供可视化的图表和数据，，可实时提醒用户试剂量的减少或 QC 样品结果的变化等，是一种全自动化的分析系统。该方法可供临床实验室参考。 ( 参考文献 ) ( [1] Schulz M， Iwersen-Bergmann S， Andresen H， S chmoldt A. Therapeutic and blood concentration of nearly 1000 drugs and other xenobiotics. Critical Care 2012；16：R136. ) 此联用系统能在线自动处理样品且数据重复性好，消除手动操作生物样品带来的风险，很大限度地减少操作人员与生物样本的接触，放入采血管、必要试剂和专用处理管，便可进行在线自动前处理，每个样品并行处理，以优化仪器的使用和样品通量，并且通过软件来管理试剂、校准曲线、控制样品和系统维护，确保系统的性能和可靠性，系统提供可视化的图表和数据，可实时提醒用户试剂量的减少或 QC 样品结果的变化等，是一种全自动化的分析系统。