血清样本中抗精神病药物及其代谢物检测方案(液质联用仪)

SSL-CA14-994Excellence in Science Excellence in ScienceLCMS-QTOF-012 岛津企业管理(中国)有限公司分析中心Shimadzu(China)CO.，LTD. Analytical Applications Centerhttp：//www.shimadzu.com.cn上海市徐汇区区州路180号B2栋咨询电话：021-34193996Hotline：021-34193996Building B2， No.180 Yizhou Road， Shanghai LCMS-9030 液相串联四极杆飞行时间质谱仪定性分析抗精神病药物及其代谢物 LCMS-QTOF-012 摘要：本文利用岛津公司 LCMS-9030 超高效液相色谱与四极杆飞行时间质谱联用仪对常见的抗精神病药物及其代谢物进行鉴定。采用蛋白沉淀的前处理方式，结合高分辨质谱特性可以快速定性分析药物及其代谢物，结果显示：在14个临床血清样本中定性分析出23种抗精神病药物及其代谢物，其中定性出的10种原药与给药情况基本吻合，所有化合物的质量数偏差均小于2 ppm， 其定性出的药物与代谢物在做多样本测试中能重现。岛津 QTOF 质量数偏差小、软件多元化，可以进行快速、准确的定性分析。 关键词：LCMS-9030 四极杆飞行时间质谱血清精神病药物 非典型抗精神病药物(又称第二代抗精神病药，atypical antipsychotics， AAs)， 包括氯氮平、奥氮平、利培酮、喹硫平、阿立哌唑、齐拉西酮等药物，与传统抗精神病药物相比，具有作用谱广、疗效好、安全性好等优点，能提高患者的生活质量。非典型抗精神病药物的代谢主要经细胞色素 P450酶 (CYP)系统代谢，影响药物代谢酶活性的各种因素均可能导致非典型抗精神病 药物代谢的改变，从而升高或降低血药浓度，使药理作用和毒性作用发生改变；尤其目前为达到最佳治疗效果常使用联合用药，药物的相互作用也会影响代谢情况，因此监控其代谢物为临床用药提供参考。 本文利用岛津公司 LCMS-9030 超高效液相色谱与四极杆飞行时间质谱联用仪定性分析常见的抗精神病药物及其代谢物，供临床研究人员参考。 1.1仪器 岛津 LCMS-9030超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱联用仪，具体配置： LC-30AD×2输液泵， DGU-20A5R在线脱气机， SIL-30AC 自动进样器， CTO-20AC柱温箱， CBM-20A 系统控制器， LCMS-9030 四极杆飞行时间质谱仪，LabSolutions V5.96 工作站软件。 1.2分析条件 液相色谱条件流速： 0.3 mL/min分析仪器：LC-30A 系统进样体积：5uL色谱柱： Shim-pack GIST， 2.1 mm l.D.柱温：40℃×100 mm L.，2.0 um洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为10%，时流动相：A：0.1%甲酸水溶液；B：乙腈间程序见表1。 表1时间程序 时间(min) 单元 命令 值 1.00 泵 B.Conc 10 6.00 泵 B.Conc 95 7.00 泵 B.Conc 95 7.10 泵 B.Conc 10 10.00 控制器 Stop 质谱条件 离子源： ESI，正离子扫描 脱溶剂管温度：150℃ 离子源接口电压： +4.0kV 加热模块温度：500℃ 雾化气：氮气3.0 L/min 接口温度：300℃ 干燥气：氮气10 L/min 加热气：空气10 L/min 扫描模式： MS Scan (m/z 100-800)&DDA (m/z 50-800) 碰撞气：氩气 1.3样品前处理 准确量取 300 pL血清样品置于EP管中，再加入900 uL乙腈，振荡1 min， 以10000 r/min 离心 10 min 后，取上清液至1.5mL样品瓶，待测。 样本：收集了14个给药的病人血清样本，2个空白人血清样本 结果与讨论 2.1以4号样本为例进行定性分析 4号样本给了3种药：利培酮、9-羟基利培酮、氟伏沙明。参考给药信息，结合代谢物库，使用 LabsolutionsInsight Explore 软件和分子式预测软件，对照空白血清样本MS，从4号样本的 MS'TIC 图中初步筛选出添加的药物及其可能的代谢物，给出 m/z和分子式。再对其 MS质谱图进行进一步的定性分析。 2.1.14号样本的色谱图 图14号样本的BPC图(基峰图) 2.1.2根据MS筛查出可能的化合物 表24号样本初步筛选出的结果 编号 化合物 保留时间 实测m/z 理论m/z 相对误差 (ppm) 同位素得分 预测的分子式 M+H+ [M+H]+ 1 利培酮 4.70 411.21921 411.21908 0.29 97.5 C23H27N402F 2 9-羟基利培酮 4.64 427.21411 427.21400 0.24 98.5 C23H27N403F 氟伏沙明 5.30 319.16305 319.16279 0.98 98.2 C15H21N202F3 氟伏沙明-代谢物1 6.52 361.17362 361.17335 0.74 99.1 C17H23N2O3F3 5 氟伏沙明-代谢物2 4.95 319.12657 319.12640 0.55 99.6 C14H17N203F3 图24号样本初步筛选出m/z的EIC图(提取离子流图) 图3 Labsolutions Insight Explore软件中分子式预测结果的截图 2.1.3 MS质谱图的解析 <1>氟伏沙明、利培酮、9-羟基利培酮三种给药的MS分析 以氟伏沙明为例：通过MS预测出可能的分子式后，初步判断可能是氟伏沙明。利用 ACDmanager 软件中碎片离子预测的功能，比较理论的 MS²碎片离子与实测的 MS’质谱图，其结果吻合如图4所示(红色线部分表示匹配上的离子)，再次确认 m/z 319.16309 为氟伏沙明。说明4号样本中含有氟伏沙明。 同样方法确认4号样本中含有利培酮和9-羟基利培酮(如图5-6)。9-羟基利培酮又名帕潘立酮，是利培酮主要的代谢产物，可以做为联合给药的一种，同利培酮一起给药。 图44号样本中氟伏沙明(m/z319.16305)的MSI和MS2质谱图及其ACD软件匹配结果 图54号样本中利培酮 (m/z 411.21921) 的MSI和MS²质谱图及其ACD软件匹配结果 图64号号本中9-羟基利培酮(m/z 427.21411) 的MSI和MS²质谱图及其ACD软件匹配结果 <2>2种氟伏沙明代谢物的 MS分析 代谢物1分子式是 C17H23N203F3和氟伏沙明分子式 C15H21N202F3相比，相差了 C2H2O， 将代谢物1的MS²质谱图与氟伏沙明的 MS²谱谱图对比，两者的 m/z 258以前的部分主要碎片离子是吻合的，具体的碎片离子结果如图7所示，因此该代谢物2可能是氟伏沙明乙酰化后的产物。 图7氟伏沙明代谢物1的MSI和MS质谱图(上图)以及MS²碎片离子解析结果(下图) b、代谢物2： m/z319.12657 代谢物2分子式是 C14H17N2O3F3，，通过公共数据库 ChemSpider 或 Metlin 搜索，得到其可能是Fluvoxamine Acid，根据其结构式，利用 ACD 软件预测出理论的二级碎片离子，并与实测的 MS?质谱图上的离子比较。80%以上的离子吻合，说明代谢物2可能是氟伏沙明的代谢产物；是氟伏沙明去甲基脱氢氧化 (+O，-CH2，-H2)后的产物。 319.2657 312.2 141.09086 258.07387 MS 21719 356.26457545. 7449160 1.2251.00-0.25 145.02591 113.01908 162. 160.03730 .005313 188.03259 230.07992 198.05419 MS’： m/z 319.12657 230.07992 258.07642302.10109 图8氟伏沙明代谢物2的MS和MS²质谱图 图9·代谢物2(m/z319.12657) ChemSpider搜索结果与ACD软件匹配结果 2.2分析多个样品中利培酮、9-羟基利培酮、氟伏沙明及其代谢物 对含有利培酮、9-羟基利培酮和氟伏沙明药物的样本进行测试，并列出利培酮、氟伏沙明及其代谢物的质量数精度与强度。即使质量数强度不同，质量数偏差都是<2 ppm。 表3多个样品中利培酮、9羟基利培酮的质量准确度及其强度 样本编号 利培酮(理论m/z411.21908) 9-羟基利培酮(理论m/z427.21400) 实测m/z 偏差 峰面积 1 实测m/z 偏差 峰面积 1号 1 411.21922 0.34 206550 1 427.21410 0.25 290987 2号 411.21923 0.36 223013 427.21425 0.60 235650 3号 411.21940 0.78 153289 1 427.21439 0.92 179631 4号 1 411.21921 0.29 179868 1 427.21411 0.24 175915 11号 411.21974 1.56 33709 427.21472 1.51 306716 表44多个样品中氟伏沙明及其代谢物的质量准确度及其强度 样本编号 氟伏沙明 氟伏沙明代谢物1 氟伏沙明代谢物2 (理论m/z319.16279) 1 (理论m/z361.17335) 1 1 (理论m/z319.12640) 实测m/z 偏差 峰面积 1 1 实测m/z 偏差 峰面积 1 实测m/z 偏差 峰面积 1号 319.16267 -0.37 239073 361.17339 0.10 239775 319.12632 -0.26 62926 319.16305 0.26 808066 361.17362 0.74 791777 1 319.12658 0.55 392141 4号 1 1 319.16328 0.63 2500583 1 361.17391 1.10 1074572 319.12678 0.62 337791 13号 2.314个样本中定性出抗精神病药物与代谢物的结果汇总 参考3.1定性手段，从14个样本中定性出23种抗精神药物及其代谢物，结果见表5。 表523种精神病药物及其代谢物的定性结果 编号 化合物 保留时间 理论m/z[M+H]+ 分子式 代谢途径 1 利培酮 4.71 411.21908 C23H27N402F - 2 9-羟基利培洞 4.65 427.21400 C23H27N4O3F 氧化 3 氟伏沙明 5.30 319.16279 C15H21N2O2F3 - 4 氟伏沙明-代谢物1 6.53 361.17335 C17H23N203F3 乙酰化 5 氟伏沙明-代谢物3 4.95 319.12640 C14H17N203F3 氧化+去甲基+脱氢 6 阿立哌唑 5.32 448.15531 C23H27N302CI2 - 7 阿立哌唑-代谢物1 5.20 446.13966 C23H25N302CI2 脱氢化 8 奥氮平 3.60 313.14814 C17H20N4S - 9 奥氮平-代谢物1* 4.51 329.14306 C17H20N4OS 氧化 10 阿普唑仑 5.72 309.09020 C17H13CIN4 - 11 舍曲林 5.49 306.08110 C17H17CI2N - 12 舍曲林-代谢物1* 5.42 292.06543 C16H14CI2N 去甲基化 13 舍曲林-代谢物2 6.29 498.10808 C23H25NO7CI2 氧化+葡糖醛酸化 14 舍曲林-代谢物3 6.21 350.07153 C18H17NO2CI2 15 舍曲林-代谢物4* 6.67 306.04537 C16 H13NOCl2 氧化+去甲基+脱氢 16 舍曲林-代谢物5* 6.07 336.05551 C17H15NO2CI2 羧基化 17 舍曲林-代谢物6* 6.02 484.09243 C22H23NO7CI2 去甲基+氧化+葡糖醛酸化 18 艾司西酞普兰 8.68 325.17110 C20H21FN2O 19 艾司西酞普兰-代谢物1 5.06 311.15540 C19H19FN20 去甲基化 20 氨磺必利 4.24 370.17950 C17H27N304S - 21 齐拉西酮 4.97 413.11974 C21H21CIN4OS - 22 齐拉西酮-代谢物1* 5.76 429.11465 C21H21N402SCI 氧化 23 齐拉西酮-代谢物2* 4.187 443.09392 C21H19N4O3SCI 羧基化 备注： 66*79：响应较弱，无法对二级碎片进行分析；仅通过MS1来推测的结果。 23种药物及其代谢物在14个样本中 MS质量数偏差分布如图10所示， 均在2 ppm以内；这些药物在样本中的具体检出结果如表6所示。 LCMS-QTOF-012 图1014个样本中23种代谢物质量数偏差的分布图 图623种药物及其代谢物在14个样本中的检出结果(●表示检出) No. 化合物 理论m/z[M+H]+ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1 利培酮 411.21908 ● 2 9-羟基利培酮 427.21400 3 氟伏沙明 319.16279 4 氟伏沙明-代谢物1 361.17335 5 氟伏沙明-代谢物2 319.12640 6 阿立哌唑 448.15531 7 阿立哌唑-代谢物1 446.13966 8 奥氮平 313.14814 9 奥氮平-代谢物1 329.14306 10 阿普唑仑 309.09020 11 舍曲林 306.08110 12 舍曲林-代谢物1 292.06543 13 舍曲林-代谢物2 498.10808 14 舍曲林-代谢物3 350.07153 15 舍曲林-代谢物4 306.04537 16 舍曲林-代谢物5 336.05551 17 舍曲林-代谢物6 484.09243 18 艾司西酞普兰 325.17110 19 311.15540 艾司西酞普兰-代谢物1 20 氨磺必利 370.17950 21 齐拉西酮 413.11974 22 齐拉西酮-代谢物1 429.11465 23 齐拉西酮-代谢物2 443.09392 2.4空白血清中的MIC图 平行测试2个空白血清，上述检出的23种药物及其代谢物均未检出。空白血清样品的提取离子流图如图11所示。 图11空白血清的MIC图 结论 本文利用岛津公司 LCMS-9030 超高效液相色谱与四极杆飞行时间质谱联用仪定性分析临床病人血清中精神病药物及其代谢；从14个临床血清样本中定性分析出10种常见的抗精神病药物和13种其相关代谢物，定性出的10种原药与给药情况基本吻合。岛津 LCMS-9030 高分辨质谱具有质量数准确性高，一级质谱数的偏差均在2 ppm以内；分子式预测软件、ACDmanager 软件等多元化的辅助定性软件，可以简单、快速的进行定性分析；为临床监控药物的快速定性分析提供参考。 致谢：该报告是与广州医科大学附属脑科医院合作完成，感谢其提供测试样本。 本文利用岛津公司LCMS-9030超高效液相色谱与四极杆飞行时间质谱联用仪对常见的抗精神病药物及其代谢物进行鉴定。采用蛋白沉淀的前处理方式，结合高分辨质谱特性可以快速定性分析药物及其代谢物，结果显示：在14个临床血清样本中定性分析出23种抗精神病药物及其代谢物，其中定性出的10种原药与给药情况基本吻合，所有化合物的质量数偏差均小于2 ppm，其定性出的药物与代谢物在做多样本测试中能重现。岛津QTOF质量数偏差小、软件多元化，可以进行快速、准确的定性分析。