蕲蛇中品种鉴别检测方案(生物质谱)

SSL-CA14-835Excellence in Science Excellence in ScienceMultiNA-025 上海市徐汇区宜州路180号华鑫天地二期C801栋 咨询电话：021-34193996 http：//www.shimadzu.com.cnBuilding C801， No.180 Yizhou Road， Shanghai Hotline： 021-34193996 应用微芯片电泳仪 MultiNA 鉴定中药材蕲蛇 MultiNA-025 摘要：本文应用2015版《中国药典》中的蕲蛇特异性引物对蕲蛇中药材裂解后的消化产物进行PCR扩增反应，通过微芯片电泳 MultiNA 检测扩增产物，结果显示其凝胶图谱中不仅在300-400 bp 之间有单一条带，电泳图谱中还能得到片段尺寸信息。本实验表明，相比传统的琼脂糖凝胶电泳， MultiNA同样适用于《中国药典》中规定的利用聚合酶链式反应法(PCR)对中药材蕲蛇的鉴定，而且分辨率更高、检测更加灵敏、操作简便、快速、全自动化分析，通量更高，是中药材品种鉴定的有力分析方法。 关键词：MultiNA PCR 蕲蛇中药材品种鉴定 中药是中国传统的药材，中国药文化源远流长、 《中国药典》中规定利用聚合酶链式反应法对一些方博大精深，种类繁多，来源广泛。外观相似的不同 剂中药物品种的来源，以及易混淆的不同品种中药材品种的中药材可能疗效相差甚远，价格也有较大差 如川贝母、蕲蛇、乌梢蛇等进行鉴别。为此，这里应异，甚至某些不法商家为谋取不当利益，故意进行 用PCR的方法，结合岛津微芯片电泳仪 MultiNA 实掺混或掺假。传统的中药材鉴别方法如感官识别、 现了对蕲蛇药材的快速检测。相比药典中规定的琼脂性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定等存在一定局限性， 糖凝胶电泳检测的方法，此方法操作简单，分辨率更为保证中药材临床用药安全、准确和有效，2015版 高，可快速实现中药材品种的鉴别。 I实验部分 1.1仪器 微芯片电泳 MCE-202MultiNA 1.2试剂 Ampdirect@Plus (Shimadzu， S241-08800-99) IMMOLASETM DNA Polymerase (Bioline， BIO-21046) SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (Invitrogen， S-11494) DNA-500 Reagent Kit for MultiNA (Shimadzu，292-27910-91) 25 bp DNA Ladder (Invitrogen， 10597-011) 样品：蕲蛇(中药材) 引物：引物序列来自2015版《中国药典》，由生工生物公司合成。具体引物信息见表1。 表1 蕲蛇PCR扩增引物序列 引物 序列 PCR理论产物大小(bp) 正向引物 5'-GGCAATTCACTACACAGCCAACATCAACT-3' 343 反向引物 5’-CCATAGTCAGGTGGTTAGTGATAC-3' 1.3分析条件 DNA-500 on-chip。 1.4实验方法 取适量中药材蕲蛇样品进行液氮研磨，称取100 mg 粉末加入1mL入胞裂解液(0.5% SDS， 400 mMNaCl， 0.1 M EDTA， 10 mM Tris-HCl， pH 8.0) 和5uL蛋白酶K(20ug/uL)，混匀后55℃孵育30 min， 取消化产物进行 PCR扩增反应， PCR反应体系及反应条件分别见表2及表3。为了验证测量的准确性，实验中设计了阴性对照，阴性对照不加入 DNA模板。PCR产物进入微芯片电泳仪 MultiNA 进行测定。根据理论产物片段大小，选用 DNA-500 的试剂盒进行检测。 表 2 PCR 反应体系 反应试剂 使用量(uL) Ampdirect @Plus (2x) 10 PCR Forward Primer (10 uM) 1 PCR Reverse Primer (10 uM) 1 模板(消化产物) 0.2 IMMOLASETM DNA Polymerase (5U/uL) 0.1 dH，0(灭菌蒸馏水) 7.7 总体积 20 表 3PCR反应条件 作用 温度/℃ 时间 预变性 94 10 min 扩增(35个循环) 变性 94 30s 退火 58 30s 延伸 72 30s 循环后延伸 72 7 min I结果讨论 图1是使用蕲蛇特异性引物进行 PCR扩增后，应用 MultiNA对扩增产物进行检测的凝胶图，从图上可以看到，只有蕲蛇样品在目的片段大小附近有明显条带，阴性对照没有条带。图2是是蛇样品检测的电泳图，图上显示出349 bp的信号峰，与理论大小343 bp接近，考虑到仪器在 DNA-500 on-chip模式下具有5%的误差，结果合理，说明使用蕲蛇特异性引物成功鉴定蕲蛇样品。 2015版《中国药典》中规定对蕲蛇样品进行 PCR 扩增后，需按照脂脂糖凝胶电泳法进行电泳检测，供试品凝胶电泳图谱中，在与对照药材凝胶电疑胶谱相应的位置上，在300-400 bp 之间应有单一 DNA 条带。相比传统的琼脂糖凝胶电泳法，利用 MultiNA对 PCR产物进行检测，不仅成功在300-400 bp 之间显示出单一条带，还能够通过电泳图得到片段的尺寸信息，灵敏度高，为通过片段尺寸大小鉴别不同种类的中药材提供可能。MultiNA 操作简便，全自动化分析，相比传统的电泳方法，适用于高通量的中药材样品检测。 图1蕲蛇样品 MultiNA检测凝胶图 (NC：阴性对照) Size (bp) 图2蕲蛇样品MultiNA检测电泳图 I结论 本文基于分子生物学技术，采用岛津公司微芯片电泳仪MultiNA 成功对中药材蕲蛇进行鉴定，不仅在凝胶电泳图谱中300-400 bp 之间有单一条带，还能通过电泳图得到片段尺寸信息，误差在5%以内。此方法相比传统的琼脂糖凝胶电泳，更加高效、灵敏，分辨率高，操作简便，全自动化分析，通量高，是中药材品种鉴定有力的分析方法。 岛津企业管理(中国)有限公司分析中心 Shimadzu(China)CO.，LTD. Analytical Applications Center 本文应用2015版《中国药典》中的蕲蛇特异性引物对蕲蛇中药材裂解后的消化产物进行PCR扩增反应，通过微芯片电泳MultiNA检测扩增产物，结果显示其凝胶图谱中不仅在300-400 bp之间有单一条带，电泳图谱中还能得到片段尺寸信息。本实验表明，相比传统的琼脂糖凝胶电泳，MultiNA同样适用于《中国药典》中规定的利用聚合酶链式反应法（PCR）对中药材蕲蛇的鉴定，而且分辨率更高、检测更加灵敏、操作简便、快速、全自动化分析，通量更高，是中药材品种鉴定的有力分析方法。