极性化合物中典型应用文集检测方案(液相色谱柱)

目录 了解HILIC的工作原理 极性化合物典型应用文集 极性化合物保留策略 HILIC保留机制 生物分析/临床检测 乙酰胆碱 一元胺类神经递质 卡因类局部麻醉药 血浆中儿茶酚胺及肾上腺素 吗啡代谢物 去氨加压素 检测血浆中脂类物质如：卵磷脂 2三聚氰胺2 利巴韦林 氨基糖苷类抗生素 13种-N亚硝胺类化合物 糖异构体的分离 丙烯酰胺 离子型极性农药 百草枯与敌草快 极性保留策略树(反相、亲水作用色谱) 首试条件： T3柱一低pH(pH3)， 高水相(>95%)；T3柱可兼容100%水相，可筛选pH 2-7。 XBridge Shield RP18柱一碱性分析物高pH(pH10)， 高水相(>95%)；该柱可兼容100%水相，可筛选pH3~10。 XBridge Amide柱一乙腈：水95：5，中等pH(pH5， 流动相含10mM醋酸铵和0.02%醋酸)；酸性、中性与混合分析物首选该柱，该柱可筛选条件pH3~10. XBridge HILIC柱一乙腈：水95：5，中等pH(pH5， 流动相含10mM醋酸铵和0.02%醋酸)；碱性分析物首选该柱，该柱可筛选条件pH2~8。 Atlantis/CORTECSHILIC柱一乙腈：水95：5，低pH(pH3， 流动相含10mM甲酸铵和0.2%甲酸)；碱性分析物首选该柱。 了解HILIC的工作原理 保留机制 一如色谱学中的所有机制作用，任何一种分离总是受各种溶质之间的相互作用以及这些溶质在流动相和固定相之间的动态平衡所支配。在HILIC中，保留机制是液液液分配、吸附作用、离子相互作用和亲水性保留作用的复杂的多模式组合，从而使HILIC与RPLC相比具有独特的选择性和保留特性[图1]。然而，单一的保留机制并非主导所有分离。分析物的成功保留主要取决于流动相的组成[有机溶剂和pH]、流动相与固定相的相互作用及分析物的化学性质和结构组成。 图1：因HILIC因其多模式保留机制，具有相对于反相色谱的正交性的选择性，在HILIC的色谱条件下，吗啡的葡萄糖苷酸代谢物继吗啡之后被洗脱。 HILIC是正相色谱的变体，其保留强度与溶质极性成正比，而与流动相极性成反比。因所使用的固定相为极性[即：未衍生化硅胶或杂化颗粒、酰胺基、氨基、二醇、两性离子等]，故可轻易吸附水及其它极性溶剂。极性分析物随固定相极性的增加和流动相极性的降低表现出更强的保留。这是基于相似相容的原理。如果固定相比流动相具有更强的亲水性，则极性分析物倾向于与固定相作用，从而增加保留。然后，通过逐渐增加流动相的极性而使分析物依次洗脱[在HILIC中，水是最强的洗脱溶剂]。尽管在流动相中增加极性溶剂的量可促进洗脱过程，然而，该极性溶剂的存在还可使固定相表面吸附上一层极性层，对于建立液液液分配从而获得对极性分析物的保留是必不可少的[图2]。 图2：在固定相表面吸附一层极性溶剂对于保留极性化合物而言是必不可少的。在这里，我们观察到极性碱性化合物[胞嘧啶]在流动相和固定相表面吸附水层之间的液一液分离。 在HILIC中，吸附和分配保留机制相互关联。吸附保留机制只是简单的溶质与流动相之间对于固定相上的极性吸附位点的竞争。而分配保留机制则是由于分析物在流动相和固定相表面的吸附水层上的溶解度差异。为使填料表面形成亲水层，流动相中至少包含3%的极性溶剂，才可使固定相充分的与水结合[溶剂化]。(有关HILIC色谱柱的使用注意事项，见最后一页)。 各填料色谱柱特点 HtlANtis°Columns Atlantis° HILIC Silica (pH1-5)规格： 3 pm， 5 pm 及制备 Linker ar CORTECS COLUMNS 规格：1.6pm，2.7pm CORTECS° HILIC Silica (pH 1-5) D- ACQUITY UPLC° BEH Amide XBridge° Amide (pH 2-11) BEH Technology~ NH2 规格：1.7um， 2.5 pm， 3.5 um， 5 pm 及制备 Acquity ACQUITY UPLC° BEH HILIC Bridge XBridge°HILIC (pH 1-9) COLUMNS， 规格：1.7um，2.5 pm， 3.5 pm， 5 um 及制备 色谱条件 色谱柱： HSS T3 4.6x150 mm， 5 um OH 0 OH 部件编号： 186004791 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 甲基咪唑(具体条件参考应用资料：720005200EN) 转化糖(具体条件参考应用资料：国家食品药品监督管理局国家药品标准) 国家食品药品监督管理局国家药品标准 注射用转化糖 Zhu she yong Zhuan hua tang Invert Sugar for Injection 含量测定：照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录VD)测定。 色谱条件与系统适用性试验：用酰胺基三键合亚乙基桥杂化颗粒为填充剂(推荐色谱柱为： Waters XBridge Amide，4.6 mmx 150 mm， 3.5 um或效能相当的色谱柱)，以乙腈-水-浓氨溶液(80：20：0.1)为流动相，示差折光检测器，检测器温度和柱温均为40℃。取果糖与无水葡萄糖适量，用乙腈溶液(75→100)制成每1ml中含果糖和无水葡萄糖分别约为5 mg的溶液，量取20uL， 注入液相色谱仪，果糖峰与无水葡萄糖的分离度应符合要求。 二甲双胍(具体条件参考应用资料：720004080ZH) 阿昔洛韦和鸟嘌呤分析(具体条件参考应用资料：720004739ZH_CORTECS色谱柱应用文集_WA64666) 1.Acyclovir (50 pg/ml)2. Guanine (50 pg/mL) 0.08- 006- 仪器： ACQUITY UPLC配置PDA检测器 色谱柱： CORTECS HILIC 1.6 um 2.1x100 mm 分离模式： 等度(流动相A：B 15：85) 流动相A： 0.2%甲酸水 流动相B： 0.2%甲酸乙腈 检测波长： 254 nm 流速： 0.6 ml/min 柱温： 30°℃ 稀释剂： 0.02N NaOH的乙腈/水60：40 核酸类分析(具体条件参考应用资料：720004739ZH_CORTECS色谱柱应用文集_WA64663) 小肽分析(具体条件参考应用资料：720004739ZH_CORTECS色谱柱应用文集_WA64668) Histidine Dipeptides 0.0- Compounds：1. Creatine， m/z 132 (1 pg/mL)2. Carnosine，m/z 227 (1 pg/mL) 3. Anserine， m/z 241 (5 pg/mL) 有机膦酸(具体条件参考应用资料： ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱应用文集_WA60104) 2| 5. Ethyl methylphosphonic acid (EMPA) 合成氨基酸(具体条件参考应用资料：高效液相色谱法测定门冬氨酸鸟氨酸注射液的含量) 高效液相色谱法测定门冬氨酸鸟氨酸注射液的含量 缪宁梅'，马婕? 江苏省药品检验所，江苏南京210008；；2中国药科大学，江苏南京210009 色谱柱和流动相的选择经反复试验，用氨基键合硅胶色谱柱；以乙腈-0.05mol/L 磷酸二氢钾溶液(50：50)为流动相；流速为1.0 mL/min。理论塔板数按鸟氨酸峰计算应不低于5000。在此色谱条件下，供试品及对照品的HPLC色谱图见图1。鸟氨酸与门冬氨酸及氯离子峰的分离度均大于9.0。 备注：由于硅胶氨基柱耐受性差，很难达到理论塔板数的要求，所以客户使用XBridge Amide 4.6x250 mm， 5pm， 按照上述方法，耐受性及理论塔板数均符合要求。谱图见： 糖肽(具体条件参考应用资料：2016耗材手册 P164) 选择能够兼顾分离度需要与样品分析通量要求的色谱柱柱长。 注：具体应用请见应用纪要720004857EN Amide-Bonded BEH HILIC Columns for 糖(纤维水解物)(具体条件参考应用资料： ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱应用文集_WA60127) 还有牛奶/提子麦片/啤酒/食用糖/蜂蜜/炸土豆/止咳糖浆(BEHAmide文集) 抗坏血酸及异抗坏血酸(具体条件参考应用资料： WA60102) 色谱条件 人参皂苷(具体条件参考应用资料： BEH Amide_Ginseng Root Powder_wa64083) 复方丹参滴丸 复方丹参滴丸 Fu Fang Danshan Diwan 【处方】丹参三七冰片 【含量测定】照高效液相色谱法(通则0512)测定。 【色谱条件与系统适应性试验】用Waters ACQUITY UPLC HSST3(柱长为100 mm， 内径为2.1 mm， 粒径为1.8 pm)色谱柱，以含0.02%磷酸的80%乙腈溶液为流动相A， 以0.02%磷酸溶液为流动相B， 按下表中的规定进行梯度洗脱，流速为每分钟0.4ml；检测波长为280nm；柱温为40℃。理论板数按丹参素峰计算应不低于8000。 维生素(T3) 8 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00Minutes 乙酰胆碱(具体条件参考应用资料： LC/MS Isocratic Separation of Neurotransmitters on XBridge HILIC) 色谱条件 色谱柱： XBridge HILIC 21x50 mm 3.5 um 部件编号： 186004432 H3C .OH .CH3 流动相A： 含0.125%甲酸的10mM甲酸铵水溶液 H3C CH3 流动相B： 含0.125%甲酸的10mM甲酸铵 CH3 0 在乙乙：甲醇：水90：5：5 Acetylcholine (Ach) Choline (Ch) 等度的模式 流动相比列： 10%A：90%B 流速： 0.5 ml/min 注入体积： 10 pl 稀释剂： 0.2%甲酸乙腈：甲醇 75：25 样品浓度： 5 ng/ml 柱温： 30°C 检测器： 质谱 仪器： ACQUITY UPLC配置TQD 一元胺类神经递质(具体条件参考应用资料：720004389ZH_使用XBridge BEH Amide XP 色谱柱， 按HILIC色谱机理对一元胺类神经递质进行LC/MS/MS分析) LC条件 仪器： ACQUITY UPLC系统 色谱柱： XBridge BEH Amide XP， 2.1 x75 mm， 2.5 pm货号： 186006090 流动相A： 95：5 H，O：ACN w/100mMNHHCOO(pH 3.0) 流动相B： 85：15 HO：ACN w/30mM NHHCOO(pH 3.0) 初始的流动相条件是100%的流动相A，在3.5分钟内流动相B升高到30%。然后在0.1分钟内流动相A回到100%，运行1.4分钟。流速为0.5 mL/min。进样体积为20uL。 质谱条件： 仪器： Waters XevoTQ-S质谱仪 离子源： ESI+ 图1.分别使用 Waters XBridge BEH Amide XP 和 XBridge BEH HILIC XP色谱柱分析一元胺类化合物的色谱图。分析物：1-NMS， 2-5-HT， 3-DA， 4-EP， 5-NE 卡因类局部麻醉药(具体条件参考应用资料：720004737ZH_利用CORTECS UPLC色谱柱改善分离度) H2N 利多卡因 布他卡因 (即峰1) (即峰2) H，N 丁卡因 普鲁卡因 (即峰3) (即峰4) HN 普鲁卡因胺 (即峰5) LC条件 梯度条件如表1所示，包含初始平衡条件，随后缓慢上升且流速增大，以重新平衡色谱柱。整个循环时间为4.0 min。 MS条件 MS系统： Xevo TQ-S 电离模式： ESI+ 毛细管电压： 0.5 kV 锥孔电压： 视化合物而定(见表2) 去溶剂气流速： 900 L/h 锥孔气流速： 150 L/h 去溶剂气温度： 550℃ 源温度： 150℃ 梯度： 时间 流速 %A %B 0.0 100.0 0.0 100.0 2.0 0.6 10.0 90.0 10.0 90.0 30.0 70.0 2.6 100.0 3.9 100.0 4.0 100.0 图1.儿茶酚胺和变肾上腺素的名称、分子结构和logP值。 图2B.儿茶酚胺和变肾上腺素在ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱(1.7 pm，2.1x100 mm)上得到的色谱图。代表性方法空白。所有化合物的内源性浓度列于表3中。 吗啡代谢物(具体条件参考应用资料：720004739ZH_CORTECS色谱柱应用文集_WA64662) 去氨加压素(具体条件参考应用资料：720004056EN) 色谱条件： ACQUITY UPLC System with Binary Solvent Manager， Column Manager， and Sample Manager 色谱柱： ACQUITY UPLC HSS T3 1.8 um 2.1x100 mm 柱温： 45℃ 梯度： 30 to 95% organic over 3.5 min 质谱条件 质谱系统： Xevo TQ-S 质谱模式： Positive ion electrospray MS/MS 质谱切换： 535-328 Figure 2. LC/MS/MS chromatogram of the desmopressin Mid-LevelQC. 检测血浆中脂类物质如：卵磷脂(具体条件参考应用资料：720004048EN) 三聚氰胺(具体条件参考应用资料：婴幼儿配方乳粉和液态奶中三聚氰胺的测定) (seC) (V) (eV) 127>85 0.05 40 17 127>68 0.05 利巴韦林(参考方案：针对鸡肉中的利巴韦林测定的沃特世整体解决方案) 色谱/质谱条件 流动相：乙乙：(10mM乙酸胺+0.1%甲酸) 色谱柱： BEH Amide 2.1x100 mm 1.7 um 柱温：35℃ 进样量：2uL 梯度：时间 流速 A% B% 曲线0 0.500 5.0 95.0 -0.50 0.500 5.0 95.0 61.20 0.500 23.0 77.0 61.80 0.500 50.0 50.0 62.00 0.500 50.0 50.0 63.00 0.500 5.0 95.0 1 图为利巴韦林标准图谱浓度0.5ppb 目标化合物 检测离子 电离模式 离子对 锥孔电压 碰撞能量267>135利巴韦林 [M+Na]+ ES+ 2 34 1267>155 图为利巴韦林基质加标图谱 氨基糖苷类抗生素(PFP)(具体条件参考应用资料：720004512ZH_UPLC/MS/MS测定肉类和乳品中的氨基糖苷类抗生素) LC实验条件 运行时间： 12 min 色谱柱： ACQUITY UPLC HSS T3 1.7 um，2.1x100mm 柱温： 40 °C 流动相A： 2mmol乙酸铵水溶液 流动相B： 甲醇 流速： 0.4 mL/min MS条件 使用MassLynx软件的IntelliStartM功能自动优化电离参数和离子对。在本例中，我们利用IntelliStart的自动参数调谐功能来确定最优质谱参数，例如施加于母离子的锥孔电压和MRM通道的碰撞能量等并将方法集合至Quanpedia数据库中，一键导出方便实用。 图，13种0.1 ng/mLN-亚硝胺化合物在基质环境中的色谱图。 氨基糖苷类抗生素(HILIC)(具体条件参考应用资料：使用CORTECS HILIC色谱柱快速高效分析10种常见氨基糖苷类抗生素) English MRM Retention LOQ Compound Name Transition Time(min) (ng/mL) 468.3/163.1 妥布霉素 Tobramycin 468.5/324.1 1.87 500 478.4/156.7 庆大霉素 Gendamicin 478.4/321.8 2.10 100 卡那霉素 Kanamycin 485.2/162.5485.2/323.7 1.75 100 528.3/177.1 潮霉素B HygromycinB 528.3/352.1 1.66 100 539.9/216.6 安普霉素 Apramycin 539.9/377.8 1.87 100 586.3/163.1 丁胺卡那霉素 Amikacin 586.3/264.4 1.80 100 新霉素 Neomycin 615.4/108.8 615.4/278.8 0.40 100 大观霉素 Spectinomycin 332.8/139.6 332.8/111.6 0.90 50 链霉素 Streptomycin 581.9/262.7 581.9/245.7 1.28 50 双氢链霉素 Dihydrostreptomycin 583.9/262.7583.9/245.7 1.31 50 表1.十种常见氨基糖苷抗生素检测结果信息。 糖异构体的分离(参考文献：720005609ZH) LC条件 LC系统： ACQUITY Arc 数据系统： Empower 3 运行时间： 40.0 min 色谱柱： XBridge XP BEH Amide 2.5 um， 3.0 x150 mm柱温： 85℃ 流动相A： 90%乙腈：5%异丙醇：5%水* 流动相B： 80%乙腈：20%水* 流速： 0.8 mL/min 进样体积： 1uL 时间 流速 %A %B初始100 04.5100 018.0 010025.0 0 100251 100 040.0 0 100 0 *均含有500 ppb盐酸胍和0.05%二乙胺。 离子型型性农药(参考poster：解决食品中离子型极性农药的分析难题) 图.13种分析物的色谱图分析示例(分析物浓度为0.05mg/L， 溶剂为提取溶剂) 图1.敌草快和百草枯的结构式。 化合物 MRM 锥孔电压(V) CID (eV) 敌草快 183.1>157.1 50 25 183.1>130.1 50 30 185.1>170.1 38 22 百草枯 171.1>77.0 45 40 表1.UPLC-MS/MS分析中敌草快和百草枯所用的MRM通道。 图2.10 ppb 加标小麦面粉样品的 UPLC-MS/MS提取离子色谱图。 经证正， CORTECS UPLC HILIC分离适合与EU所采用的快速筛选法配合使用。在UPLC-MS/MS分析前，提取样品仅经过了过滤与稀释。 CORTECS UPLC HILIC法采用了等度方法(50：50乙腈/缓冲液)。因此，萃取样品仅需使用乙腈进行1：1的稀释即可实现优异的色谱性能。土豆与小麦面粉中敌草快的定量限(LOQ)低于10 ng/g。土豆中百草枯的LOQ低于10 ppb， 而小麦面粉中百草枯的LOQ约为10 ppb。 想要了解更多的应用及解决方案，请联系当地的沃特世销售人员或电话咨询：800(400)-820-2676 HILIC色谱柱的操作建议 (色谱柱： CORTECS HILIC、XBridge BEH HILIC、XBridge BEH Amide、AtlantisHILIC， 由于亲水作用色谱柱的使用方法与反相色谱柱有很大的不同，需要加以注意，可以参考《HILIC综合指南》715002531ZH。) 样品制备 应尽可能使用较高比例的有机溶剂(如95%乙腈)，以避免溶剂效应。如果存在样品溶解问题，应至少使用50/50乙腈/水，并减少进样体积。 柱平衡 初次使用时，先用50倍柱体积的50/50乙腈/水对柱进行老化；开始进样前，用20倍柱体积的起始流动相条件进行平衡；如果使用梯度条件，每次梯度之间，用8-10倍柱体积的起始流动相条件再次平衡。没有充分老化平衡的色谱柱，将会出现柱效较低、以及保留时间漂移的问题。 柱清洗再生 对于Atlantis HILIC、XBridge BEH HILIC与CORTECS HILIC色谱柱，可用梯度洗脱从97/3乙腈/水至50/50乙腈/水清洗以去除极性污染物。如果不能解决问题，可用梯度洗脱从97/3乙腈/水至5/95的乙腈/水冲洗；对于XBridge BEH Amide色谱柱，可用梯度洗脱从100%有机相到100%水相。值得注意的是当水相比例升高，压力将迅速增加，当水相比例超过60%时可适当降低流速。如果有必要可重复清洗。 柱保存 先将缓冲盐从色谱柱内冲洗干净，然后将色谱柱保存在95/5乙谱/水(XBridge BEH HILIC， CORTECS HILIC、AtlantisHILIC)或100%乙腈(XBridge BEH Amide)中。 HILIC综合指南 亲水作用色谱 Eric S. Grumbach 和 Kenneth J. Fountain Waters THE SCIENCE DF WHAT'S POSSIBLE. ACQUITY UPLC BEH AMIDE色谱柱应用文集 CORTECS 色谱柱应用文集文件编号：720004739ZH 文件编号：WA64081 沃特世科技(上海)有限公司 地址：上海市浦东新区金海路1000号 金领之都13栋 邮编：201206 电话：021-61562666 传真：021-61562777 北京分公司 地址：北京市朝阳区铜牛国际大厦 光华路15号院2号楼9层 邮编：100026 电话：010-52093866 传真：010-52932298 广州分公司 地址：广州市荔湾区中山七路50号 西门口广场1707-08室 邮编：510170 电话：020-28296555 传真：020-28296556 沃特斯中国有限公司 地址：香港新界沙田科学园 科技大道西16号907-908室 电话：852-29641800 扫一扫，关注沃特世微信 传真：852-25496802 全国免费售后服务热线： 800(400)820 2676 www.waters.com Waters THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. Waters， XBridge， Atlantis， CORTECS， Alliance， ACQUITY， QDa， ACQUITY UPLC， Xevo， MassLynx和The Science of What’s Possible沃特世公司的商标。所有其他商标属于各自所有者。 WatersTHE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 目录03 极性化合物保留策略 03 HILIC保留机制制药 05 有机酸 06 甲基咪唑 06 转化糖(葡萄糖/果糖) 07 二甲双胍 07 阿昔洛韦和鸟嘌呤分析 08 核酸类分析 09 小肽分析 10 有机膦酸 11 合成氨基酸 11 糖肽 12 糖 13 抗坏血酸及异抗坏血酸 14 人参皂苷 14 复方丹参滴丸 15 维生素(T3) 16 维生素(Amide)生物分析/临床检测17 乙酰胆碱 18 一元胺类神经递质 18 卡因类局部麻醉药 19 血浆中儿茶酚胺及肾上腺素20 吗啡代谢物 21 去氨加压素 21 检测血浆中脂类物质如：卵磷脂食品/环境 22 三聚氰胺 22 利巴韦林 23 氨基糖苷类抗生素 23 13种-N亚硝胺类化合物 24 糖异构体的分离 25 丙烯酰胺 25 离子型极性农药 26 百草枯与敌草快