API及其相关杂质的混合物中分析级方法放大为制备级方法检测方案(液相色谱仪)

WatersTHE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE，如需下载此海报，请访问WWW.WATERS.COM/POSTERS@2019 沃特世公司 API及其杂质分离方法放大到制备级SFC过程中通量、纯度和回收率的影响 Catharine Layton、Andrew Aubin、Jacquelyn Runco、Shawn Helmueller 沃特世公司，美国马萨诸塞州米尔福德，01757 简介 通过将SFC分析方法放大为制备级方法，实验室可以大量制备纯化目标化合物。某些实验室只为用户提供分析级方法，而用户必须利用该方法在严格的时间限制内获得具有指定纯度和质量的分离物。这个任务能否成功完成，直接取决于方法放大程序的准确度。这份海报以API及其相关杂质的混合物为研究对象，介绍了将分析级方法放大为为备级方法，每次运行的样品数量级从毫克(mg)放大至克(g)的过程。放大方法之后，还进行了成本和时间分析，以阐明色谱柱尺寸和通量之间的关系。 方法 仪器 分析型SFC： 制备型SFC： 分析级反相系统： Waters ACQUITY UPC系统Waters Prep SFC 150 Mgm系统Waters ACQUITY H-Class UPLC系统 分析型SFC UPC方法条件： 色谱柱： Waters Torus 2-PIC色谱柱， 4.6×100 mm， 5pm， 部件号：186008551进样模式： 混合流流速： 3.5 mL/min助溶剂： 80：20甲醇：乙腈等度分离的流动相组成： 80：20 CO，/助溶剂柱温： 室温ACQUITYPDA： 247 nm， 306 nm进样体积： 5pL二元溶剂管理器压力： 2860 psi合相色谱管理器ABPR： 2000 psi平均系统操作压力： (2860 psi +2000 psi背压)/2=2430 psi= 167 bar 软件： ChromScopeTM 2.0 Prep SFC方法条件： 色谱柱： Waters Torus 2-PIC色谱柱， 19×100 mm， 5 pm，部件号：186008586 进样模式： 改性剂流500pL 进样体积：柱温： 35°℃ 2489UV检测器： 247 nm， 306nm CO°泵压力： 137 bar ABPR压力设置： 120 bar 平均系统操作压力： (137bar + 120 bar背压)/2=129 bar 软件： ChromScopeTM 2.0 分析级反相正交馏分分析条件： mmx150 mm， 1.7 pm， 部件号： 186005298流速： 0.50 mL/min 流动相A： 0.1%甲酸水溶液 乙腈 梯度： 初始条件为20%流动相B， 保持1 min， UPLC反相色谱柱： ACQUITY CORTECS C色谱柱，2.1 流动相B： 之 后流动相B在5min内线性增加至80% 柱温： 40°C PDA检测器： 波长247 nm和306 nm， 分辨率4.8 nm， 3D数据扫描范围200-400 nm 进样体积： 5pL 压力： 9000 psi 软件： EmpowerTM 3色谱数据系统 样品溶液： API混合物(对乙酰氨基酚， Sigma-Al drich，部件号：A3035)和0.1%杂质(4- 氯乙酰苯胺， Sigma-Aldrich， 部件号： 158631，以及4-硝基苯酚， Sigma-Al drich， 部件号：241326)，使用甲醇分 别配制为浓度60 mg/mL和0.06 mg/mL 的溶液： 结果与讨论 使用混合流进样配置的UPC系统开发分析级色色分离方法。API(对乙酰氨基酚)和杂质(4-氯乙酰苯胺)可在247nm下检测， 而0.1%目标杂质(4-硝基苯酚)在该波长下的响应较低。在收集馏分的过程中，使用Prep SFC 150Mgm紫外可见检测器2489进行双波长监测(247nm， 306nm)， 以检出混合物中的所有化合物： 使用流速放大公式，将分析级方法的流速从4.6mm分析柱直接放大至19mm制备柱。选用具有相同填料、长度和粒径的分析柱和制备柱，以简化放大过程。让这些参数保持恒定，可保持柱长/粒径比(L/dp)不变，这对于确保保留时间准确度非常重要。 UPC总流速： 3.5mL/minUPCCO体积流速： 3.5 mL/min x0.80%=2.80 mL/minUPC'CO，质量流速： 2.8mL/min x0.936g/mL (CO的密度)=2.62g/min 助溶剂流速： 总流速3.5mL/min×20%=0.7mL/min 根据UPC方法的%流动相B计算助溶剂流速。 /制备级色谱柱直径\*分析流速=制备流速\分析级色谱柱直径 /19mm\*2.62g/min 分析级 CO2质量流速=45g/min制备级CO2\4.6m/19mm\X20.7mL分析级方法助溶剂流速=12mL/min 制备级方法助溶剂流速4.6mm/45g/min 制备级方法 CO2 流速+12mL/min 制备级方法助溶剂流速=57g/min制备级方法总流速12 mL/min制备级方法助溶剂流速x100=21.1%制备级助溶剂流速57g`min 总流速 分析型和制备型SFC系统在不同的平均压力下运行，可能会导致运行过程中CO的密度有差异，进而影响色谱分离。我们比较了UPC和PrepSFC 150Mgm的平均系统压力。 UPC(将psi转化为bar)： 二元溶剂管理器压力(bar)+合相色谱管理器压力(bar)平均压力=- 2 Prep SFC 150 Mgm系统(bar) CO，泵压力(bar)+ABPR仪器方法设置压力(bar)平均压力=2 两种系统的平均压力分别为167 bar和129 bar。可通过多种方法修正系统之间的平均压力差。一种方法是将ABPR仪器方法设置从120bar调整为158 bar， 补偿两种系统之间38 bar的压力差。另一种方法是提高制备型系统的CO，温度，以降低流动相粘度。本研究采用了后一种方法。我们将CO，和助溶剂温度提高至35C，如此调整之后，使用4.6 mm UPC系统和19 mm Prep SFC 150 Mgm系统进行分离时，目标杂质(4-硝基苯酚)与前一个洗脱峰之间的分离度和保留时间几乎相同，如图1所示。 图1.红框部分比较了色谱图(A)和色谱图(B)中0.1%杂质的保留时间及其与前一个洗脱峰之间的分离度。色谱图(A)为配备4.6mm色谱柱的UPC系统在Empower软件控制下采集集的色谱图；色谱图(B)为配备19mm色谱柱的Prep 150 SFC Mgm系统在 ChromScope 2.0软件控制下采集的247 nm处的色谱图。 Prep SFC 150 Mgm系统采用获专利的改性剂流进样配置。为了节省样品，通常先将UPC系统改为改性剂流进样配置，进行分析级的色谱柱容量研究。但在本例中，样品量充足。因此，我们没有将UPC改为改性剂流进样配置，而是直接进样制备级的进样体积(0.2mL、0.5 mL、1mL1.5mL和1.75mL)， 监测目标杂质的分离度，据此确定制备级分离的色谱柱容量。0.5mL的进样体积成功达到标准。 在19mm制备型SFC色谱柱上执行25次进样体积为0.5mL的重迭进样，并重复三次(图2)。将分离物定量转移至100mL容量瓶中，并用甲醇定容。 图2.重迭进样的示例ChromScope 2.0色谱图(306 nm)， 显示了系统对4-硝基苯酚的最大检测能力。目标峰以绿色突出显示，对应的采集时间为21秒。 使用反相色谱系统，通过正交检测确定化合物的回收率和纯度。第一个 纯化循环环得0.1%杂质(4-硝基苯酚)的平均回收率为92%(n=3)，平均 纯度仅为52%，这主要是样品储备液中的高浓度API(60 mg/mL)残留造 成的。 虽然我们制备的样品储备液浓度为60 mg/mL，以便于检测0.1%的目标 杂质，但高浓度API会导致固有的系统残留，因此在第一个纯化循环中， 杂质4-硝基苯酚获得足够高的回收率，但纯度较低。 将第一个纯化循环得到的分离物置于氮气下干燥，然后复溶，使其最终体积达到约10 mL。使用与第一个循环相同的参数，通过10次进样再次纯化分离物。反相色谱分析结果显示，经第二个纯化循环进一步去除API之后，4-硝基苯酚的纯度提高至99%，平均回收率为89%(表1)。 基于19mm色谱柱分离4-硝基苯酚的回收率和纯度，我们通过放大和载样量计算分析了30mm色谱柱的理论成本和纯化时间，以便进行比较(表2)我们比较了使用19mm色谱柱和30 mm色谱柱纯化10mg样品的总时间和成本(表3)。 表1：使用19mm色谱柱时的实测通量和每毫克样品对应的流动相成本。助溶剂为80%MeOH/20% ACN， 其中， MeOH=37美元/L或0.04美元/mL， ACN=110美元/L或0.11美元/mL， 20lb的罐装CO2=50美元或2.5美元/lb。 表2：使用30mm色谱柱时的通量和每毫克样品对应的流动相成本(使用几何放大公式计算得到)。 品 样品储备 每小时 预期通量 实测纯度 实测通量 助溶剂成本*/mg CO，成本/mg 循环1 0.06mg/mL 0.01% 0.5mL 13 0.39mg/h 52% 0.37 mg/h 105美元/mg 40美元/mg 循环2 0.25 52% 0.5mL 40 5.0mg/h 99% 4.5 mg/h 9美元/mg3美元/mg 30mm 样品储备 样品储备 进样次数 预期通量 实测纯度 实测通量 助溶剂成本*/mg CO成本/mg 循环1 0.06mg/mL 0.01% 13 0.98 mg/h NA NA 99美元/mg 38美元/mg 循环2 0.25mg/mL 52% 125 40 12.5 mg/h NA NA 8美元/mg 3美元/mg 表3：从API混合物中分离出纯度为99%的10 mg 4-硝基苯酚杂质的成本。 色” 估计的色谱 分离量 最终纯度 溶液的浓度 每分离助溶剂成本 每分 D成本 每分离10 n的总流动相成本 每分离10 mg的总成本(包括色谱柱成本) 分高10 mg的通量 19mm28mL 10mg 99% 0.01% 1459 26h第1个循环+2h第2个循环=28h 52% 美元 2h 30mm71mL 0.01% 美 黑 10h第1个循环+1h第2个循环=11h 52% 1h 使用ChromScope 2.0软件可以有效地分离低浓度杂质(即0.1%)。 PrepSFC 150 Mgm能够准确回收峰宽仅为数秒的化合物。 放大计算结果显示，将方法从19mm色谱柱转换至30mm色谱柱后，色谱柱体积和载样量将变为之前的2.5倍。因此，分离得到给定量分离物所需的时间也将缩短2.5倍。 在选择纯化柱直径时，采用直径较大的色谱柱可以节省时间(即提高通量)，这是一个非常重要的考虑因素。而要得到所需量的分离物，对所需材料(例如CO，和助溶剂)的要求并不会随色谱柱直径而变化。 运行第二个纯化循环可提高纯度。由于此时混合物中目标峰组分的浓度已经远远高于其它化合物，第二个纯化循环纯化分离物的通量比第一个循环高得多。 ( 参考文献 ) ( 1 . “ Runco，J. " B eg inners Guide to P reparative Chromatography". Li b rary ofCongress 2017933625， Waters Corporation， www.waters.com， 2017. ) 简介通过将SFC分析方法放大为制备级方法，实验室可以大量制备纯化目标化合 物。某些实验室只为用户提供分析级方法，而用户必须利用该方法在严格的 时间限制内获得具有指定纯度和质量的分离物。 这个任务能否成功完成，直接取决于方法放大程序的准确度。这份海报以 API及其相关杂质的混合物为研究对象，介绍了将分析级方法放大为制备级 方法，每次运行的样品数量级从毫克(mg)放大至克(g)的过程。放大方法之 后，还进行了成本和时间分析，以阐明色谱柱尺寸和通量之间的关系。结论使用ChromScope 2.0软件可以有效地分离低浓度杂质(即0.1%)。Prep SFC 150 Mgm能够准确回收峰宽仅为数秒的化合物。放大计算结果显示，将方法从19 mm色谱柱转换至30 mm色谱柱后，色 谱柱体积和载样量将变为之前的2.5倍。因此，分离得到给定量分离物所 需的时间也将缩短2.5倍。；在选择纯化柱直径时，采用直径较大的色谱柱可以节省时间(即提高通量 )，这是一个非常重要的考虑因素。而要得到所需量的分离物，对所需材 料(例如CO2和助溶剂)的要求并不会随色谱柱直径而变化。运行第二个纯化循环可提高纯度。由于此时混合物中目标峰组分的浓度 已经远远高于其它化合物，第二个纯化循环纯化分离物的通量比第一个 循环高得多。