磷光发光材料铱(III)络合物中手性分离纯化检测方案(液相色谱仪)

WatersTHE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE.使用SFC对铱(III)络合物进行手性分离纯化Jacquelyn Runco1、Andrew Aubin2、Jo-ann Jablonski?如需下载此海报，请访问WWW.WATERS.COM/POSTERS@2019沃特世公司 1沃特世公司(美国宾夕法尼亚州匹兹堡)；3沃特世公司(美国马萨诸塞州米尔福德) 简介 铱(Ⅲ)络合物在有机发光二极管(OLED)中用用作磷光发光材料，在生物应用中被用作细胞内荧光探针。具有至少两个双齿配体的八面体铱络合物呈现以金属为中心的固有立体化学结构。在合成铱(ⅢI)络合物的过程中会生成立体异构体，进而形成外消旋混合物。有趣的是，对映体纯的发射体与外消旋发射体的光物理特性之间存在差异，而这会影响设备性能。为了获得对映体纯的络合物，必须通过手性分离得到纯对映体。之前已有研究人员使用正相手性HPLC成功对铱(ⅢI)络合物进行了手性分 离。不过，SFC较之正相HPLC具有诸多优势，在手性分离和纯化中尤其如此。 本研究以两种铱(ⅢI)络合物为例(双[2-(4，6-二氟苯基)吡啶基-C，N]吡啶 甲酷合铱(ⅢI)(Flrpic)和面式-三[2-苯基吡啶-C2，N]合铱(III)(Ir(ppy)))，证明SFC分离和纯化铱(ⅢI)络合物对映体的性能(铱络合物结构如图1所示)。 本文将探讨使用Waters ACQUITY UPC 系统进行的方法筛选和方法开发，纯化过程使用Waters Prep SFC 150 Mgm系统完成。 图1：(A)双[2-(4，6-二氟苯基)吡啶基-C2，N]吡啶甲酰合铱(III) (Flrpic)和(B)面式-三[2-苯基吡啶-C2，N]合铱(III)(Ir(ppy)3)的结构。 方法 样品制备 使用10mL乙腈：异丙醇(50：50)溶解10 mg Flrpic， 制得浓度为1 mg/mL的Flrpic样品(A)。Ir(ppy)。样品(B)的溶解度非常低，因此将5 mg Ir(ppy)加入10mL乙腈中，超声处理5 min， 然后使用0.45 pm针式过滤器过滤。 分析方法筛选条件 系统： Waters ACQUITY UPC系统， 管路连接支持改性剂进样软件： MassLynx4.1软件 流速：3mL/min 梯度： 时间 (min) %CO %助溶剂 0 70 30 5 50 50 6 50 50 7 70 30 9 70 30 压力：124 bar(1800 psi) 温度：40℃ ACQUITY PDA通道1：251 nm 色谱柱：4.6x150 mm， 5 pm， Chiralpak IA 进样体积：2pL 助溶剂：文中将讨论助溶剂筛选过程 制备方法条件： 系统： Waters Prep SFC 150 Mgm 系统软件： Chromscope2.0 色谱柱：21×150 mm， 5 pm， Chiralpak IA 柱温：40℃ 压力：124 Bar 2489UV检测器： 251nm 文中将讨论流速放大和溶剂条件 馏分分析： ( 系统： Waters ACQUITY UPC2系统，管路连接支持改性剂进样软件： MassLynx 4.1软件 ) 方法：如图中所示 结果与讨论 使用5%~50%准准梯度进行初筛，结果显示无化合物洗脱，或者洗脱时间非常晚。因此，调整筛选梯度，从较高的助溶剂比例(30%)开始筛选。另外，为了选出对目标化合物洗脱效果良好的助溶剂，基于样品溶解度选择了乙乙(ACN)和异丙醇(IPA)作为备选助溶剂进行筛选。可用的制备色谱柱仅限于用于手性分离的21×150 mm， 5 pm， Chiralpak IA色谱柱，因此使用与之匹配的4.6×150 mm， 5 pm Chiralpak IA色谱柱在Waters ACQUITY UPC2系统上进行方法开发。助溶剂筛选结果如图2所示。使用乙腈/异丙醇混合物(50：50)分离Flrpic样品，获得了良好的分离结果，使用异丙醇作为助溶剂分离Ir(ppy)3样品也获得了良好的分离结果。 图2：使用4.6mm ChiralpakIA色谱柱筛选适用于Flrpic分离和Ir(ppy)s分离的助溶剂。 方法条件：总流速3mL/min， 助溶剂在5 min内从30%增加至50%，柱温40℃， 压力124 bar， 进样体积2pL。 采用等度分离条件，以便执行制备级重迭进样。基于保留时间和梯度斜率计算了洗脱先的助溶剂百分比， Flrpic样品品lr(ppy)样品的计算结果分别为38%和43%。进行SFC分离时，从洗脱百分比中扣除5%-10%这一区间，以确定等度分离的最佳起始条件。 使用该策略，确定分离Flrpic样品(图3(A))和lr(ppy)样品(图3(B))的最佳流动相条件分别为30%的50：50乙青：异丙醇和38%异丙醇。研究发现，助溶剂ACN：IPA比率(包括样品稀释剂的组成)的细微变化会显著影响Flrpic分离。在将方法放大至Prep SFC 150 Mgm系统之前， 在UPC系统上采用20pL的进样本积优化了这两种方法。 为了放大流动相条件，进行几何放大之前，将UPC的CO，流速从体积流速(mL/min)转换为质量流速(g/min)。其目的是修正UPC系统(使用体积流速)与Prep SFC 150 Mgm系统(使用质量流速)的CO，泵控制差异。确定放大后的流动相条件如下：对于Flrpic样品，60.4 mL/min， 31%；对于lf(ppy)样品， 60.7 mL/min， 39%。进样体积从4.6mm内径色谱柱上的20pL放大为21mm内径色谱柱上的420 pL。采用放大后的方法得到的色谱图见图3中的(C)和(D)，获得了良好的分离度和峰形。 rime 图3： Flrpic样品和Ir(ppy)3样品经过优化的等度分离色谱图和放大分离色谱图，分离使用的色谱柱分别为4.6 mm和21 mm Chiralpak IA色谱柱。方法条件(A)：总流速3mL/min， 30%50：50 ACN：IPA， 40℃， 124 bar， 进样体积20pL，(B)：总流速3mL/min， 38% IPA， 40℃， 124 bar，进样体积20pL， (C)：总流速60.4 mL/min，mL/min，31%50：50 ACN：IPA， 40℃， 124 bar，进样体积420pL， (D)：总流速60.7 mL/min， 39% IPA， 40℃， 124 bar， 进样体积420 pL。 使用异丙醇作为助溶剂可以成功分离Ir(ppy)样品，但考虑到该样品在乙腈中的溶解度要高得多，将乙腈用作稀释剂。由于样品溶解度有限，将进样体积增加至500pL。尽管使用改性剂进样模式引入样品，但这样羊来稀释剂会导致保留时间缩短和分离度降低，进而影响色谱分离。 进行重迭进样时，这种效应更加明显，因为样品稀释剂与之前进样的峰组分一起存在于色谱柱上。因此，为保持Ir(ppy)样品重迭进样时的分离度，将助溶剂比例降至38%异丙醇。 图4：在配备21 mm Chiralpak IA色谱柱的Prep SFC 150 Mgm系统上对Flrpic和Ir(ppy)s样品执行重迭进样，并收集Flrpic和Ir(ppy)馏分。方法条件(Flrpic)：总流速60.4 mL/min， 31% 50：50 ACN：IPA， 40℃， 124 bar，进样体积420 pL， (Ir( ppy)s)：总流速60.7mL/min， 38% IPA， 40℃， 124 bar， 进样体积500 pL。 将Flrpic馏分转移至100mL容量瓶中，使用乙腈定容。移取2.1mL(总进样体积)Flrpic样品转移至100mL容量瓶中，用乙腈定容，制得标准品。以10pL的进样体积进样分析各个标准品和两种馏分，以测定回收率。 对Ir(ppy)馏分进行旋蒸蒸发，然后转移至25mL容量瓶中，用乙腈定容。将2.5mL(总进样体积)Ir(ppy)样品转移至25mL容量瓶中，用乙腈定容，制得标准品。以20pL的进样体积进样分析各个标样和两种馏分，以测定回收率。 在ACQUITY UPC 系统上采用经过优化的等度条件分析馏分(图5)。将馏分的峰面积除以相应标准品峰的峰面积，然后乘以100，计算得到回收率。Flrpic样品馏分1和馏分2的回收率分别为95%和97%。Ir(ppy)样品馏留1和馏分2的回收率分别为87%和89%。其回收率较低可能是溶解度较低以及蒸发和复溶过程中的样品转移造成的。 Flrpic的两个馏分和lr(ppy)样品的馏分1中未检出杂杂。在Ir(ppy)样品馏分2中检测到少量杂质(约1.5%，峰1)。 124 bar， 进样体积10pL， (B)：总流速3mL/min， 38% IPA， 40℃， 124 bar， 进样体积20 pL。 ( 结论 ) 本研究利用ACQUITY UPC系统开发出等度方法，成功分离了两种铱(Ⅲ)络合物的对映体，表明SFC适用于对这类络合物进行手性分离。 实验证明，这种手性分离方法可从ACQUITY UPC系统成功放大至PrepSFC 150 Mgm系统。 通过重迭进样完成了对铱(Ⅲ)络合物对映体的纯化，得到对映体纯的馏分，并且样品回收率良好。 ( 对铱(ⅢI)络合物对映体进行SFC纯化，有利于更好地控制受其影响的光物理性质和相关应用。 ) ( 参考文献 ) ( 1 . C . C itt i， U. M . Bat t i s ti ， G . Cic c ar e lla ， V. Ma io r a no， G . G i gli， S . A bb a te， G . M a zzeo ， E. C as t iglion i ， G. Lo n g hi G . C a n na z za ， A nalytical a n d p reparati v eenantios e paration and mai n c hiroptical p r ope r ti e s of Irid i um ( I I I) ) bis(4，6-difluorophenylpyridinato)picolinato， Joumal of Chromatography A， 1467 (2016)335-346 2.D. R. Martir， C. Momblona， A. Pertegas， D.B. Cordes， A. M. Z. Slawin， H. J. Bolink， E. Zyzman-CcColman ( C h iral Iridium ( III ) Compl e xes i n Lig h t - Emitting Elec tr oche m i cal C ells： Explor i ng the I mpac t of St er eochem i s try on t he P hotophysi c al P rop e r t ie s and De vic e Perf o rmances， A CS App l ied Ma te rials & I n t e r faces， 8 ( 2 0 1 6) 3 3907 - 33915 ) ( 3 X . C he n ， Y . O k amo t o ， T. Y a no， J. O ts uki， Di r e ct e n a n ti o m e r ic separ a t i ons o f tr is( 2 - p heny l pyridi n e) i ri d i u m ( II I ) com p lexes on polysaccharide deriv a t i ve-b a sed ch i ral s t ationary p h ases， J. S e p Sci.， 3 0 ( 2 007) 713 - 7 .71 16 4. R. Chen ， J . McCaul e y， I som e r i c Separation of Cyc l ometalat e d Iridiu m (I I I) Complexe s U sing the ACQUITY ) ( U PC2 S ys te m ， 20 12， Applic a t ion Note 720004503EN5. J . R unco， A . A ubin， Practical Strateg i es fo r S u c c e ssf u l Scal in g f r o m U PC2 to Prep a rati v e SFC， C h ro ma t og raphy T oda y. V o l .1 1 ， I s su e 3(2018 ) 1 8 - 20. ) 简介铱(III)络合物在有机发光二极管(OLED)中被用作磷光发光材料，在生物 应用中被用作细胞内荧光探针1。具有至少两个双齿配体的八面体铱络合 物呈现以金属为中心的固有立体化学结构。在合成铱(III)络合物的过程中 会生成立体异构体，进而形成外消旋混合物。有趣的是，对映体纯的发射 体与外消旋发射体的光物理特性之间存在差异，而这会影响设备性能。为 了获得对映体纯的络合物，必须通过手性分离得到纯对映体2。 之前已有研究人员使用正相手性HPLC成功对铱(III)络合物进行了手性分 离3,4。不过，SFC较之正相HPLC具有诸多优势，在手性分离和纯化中尤 其如此。 本研究以两种铱(III)络合物为例(双[2-(4,6-二氟苯基)吡啶基-C2,N]吡啶 甲酰合铱(III)(Flrpic)和面式-三[2-苯基吡啶-C2,N]合铱(III)(Ir(ppy)3))， 证明SFC分离和纯化铱(III)络合物对映体的性能(铱络合物结构如图1所 示)。本文将探讨使用Waters ACQUITY UPC2系统进行的方法筛选和方法开 发，纯化过程使用Waters Prep SFC 150 Mgm系统完成。结论本研究利用ACQUITY UPC2系统开发出等度方法，成功分离了两种铱(III)络 合物的对映体，表明SFC适用于对这类络合物进行手性分离。实验证明，这种手性分离方法可从ACQUITY UPC2系统成功放大至Prep SFC 150 Mgm系统。通过重迭进样完成了对铱(III)络合物对映体的纯化，得到对映体纯的馏分， 并且样品回收率良好。对铱(III)络合物对映体进行SFC纯化，有利于更好地控制受其影响的光物理 性质和相关应用。