婴幼儿乳粉中胆碱检测方案(液质联用仪)

SSL-CA14-865Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-374 上海市徐汇区区州路180号B2栋http：//www.shimadzu.com.cn咨询电话：021-34193996Building B2， No.180 Yizhou Road， ShanghaiHotline：021-34193996 三重四极杆液质联用仪测定婴幼儿乳制品中胆碱含量 LCMSMS-374 摘要：本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪 Nexera-X2 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8045 联用测定婴幼儿乳制品中胆碱的方法。采用外标法建立校准曲线，线性良好，相关系数均大于0.999；通过低、中、高三个浓度水平的精密度实验和奶粉基质加标实验验证了方法的可靠性；定量限为1.4mg/100g；并分析了3种不同品牌的婴幼儿奶粉实际样品。 关键词：婴幼儿乳制品胆碱超高效液相色谱仪三重四极杆质谱仪 胆碱是广泛存在于生物机体中的一种强有机碱性化合物，其存在形式包括游离态胆碱、乙酰胆碱以及与卵磷脂、鞘磷脂等结合形态。研究表明，胆碱在动物生长发育过程起着重要作用，可促进大脑发育、改善大脑代谢、促进神经系统信息传递、增强视力、改善钙代谢等。因此必须在婴幼儿食品中补充， GB 10765-2010就规定了胆碱可作为婴幼儿配方食品中添加物。 胆碱在检测技术方面的报道较多，比如光度法、高效液相色谱法和液质联用法等。光度法需要进行酶反应， 酶价格偏高，检出限偏高。超高效液相色谱与质谱联用(LC-MS/MS) 法结合超高效液相分析速度快、质谱抗干扰能力强，可以在短时间内分析含量低、组分复杂的样品，已成为一种较常用的食品分析手段。 本文参考 《GB5413.20-2013食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中胆碱的测定》标准的前处理条件，建立超高效液相色谱与质谱联用测试方法，可供相关检测人员参考。 实验部分 1.1仪器 本实验使用岛津液相色谱仪 Nexera-X2 与三重四极杆质谱仪 LCMS-8045联用系统。具体配置为 LC-30AD×2(输液泵)， DGU-20AsR(在线脱气机)， SIL-30AC(自动进样器)，CTO-30A(柱温箱)!，， CBM-20A系统控制器，LCMS-8045 三重四极杆质谱仪， LabSolutions Ver. 5.91 色谱工作站。 1.2分析条件 液相色谱条件 分析仪器：Nexera-X2系统进样体积：2pL色谱柱： BEH HILIC(2.1mml.D.×100 mm L.，柱温：40℃1.7um)洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为60%，时 质谱条件 分析仪器： LCMS-8045 离子源： ESI(+) 雾化气：氮气3.0L/min 加热气：空气10L/min 干燥气：氮气10 L/min 接口温度：300℃脱溶剂管温度：250℃加热模块温度：400℃接口电压：1kV扫描模式：多反反监测(MRM) 碰撞气：氩气 MRM参数：见表2 表2 MRM参数 名称 CASNo. 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias(V) CE(V) Q3 Pre Bias(V) 60.25 -12.0 -18.0 -23.0 胆碱酒石酸氢盐 87-67-2 104.15 58.20 -12.0 -29.0 -22.0 45.20 -12.0 -22.0 -16.0 *表示定量离子 1.3样品制备 1.3.1标准溶液配制： 取 2000 ug/mL标准品溶液，用水做溶剂，配制成0.5、1.0、2.0、5.0、20、50 ng/mL 系列浓度。贮存在PP样品瓶中，待测。 1.3.2样品前处理方法： 称取2g(精确至0.01g) 混合均匀的样品，于50mL离心管中，加入12 mL 1 mol/L盐酸溶液，混匀后将离心管置于70℃水浴中，水解3h。冷却后至室温，然后用 500 g/L NaOH 溶液调 pH 为3.5~4.0， 转入100 mL容量瓶中，用超纯水定容。过滤，取上清液 0.25 mL 到 100 mL容量瓶中，用超纯水定容。再用水稀释10倍后，过0.22 um 滤膜，上机测试。(参考《GB 5413.20-2013食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中旦碱的测定》) 结果与讨论 2.1标准样品一级质谱图和产物离子扫描质谱图 图1胆碱的一级质谱图(左图)和产物离子扫描质谱图(CE值-27V，右图) 2.2标准溶液的MRM色谱图 标准溶液的 MRM 色谱如图2所示。 图2 0.5 ng/mL胆碱标样的MRM图 2.3线性关系 将标准工作液，按1.2中的分析条件进行测定，外标法制作校准曲线，如图3所示。 图3胆碱的标准工作曲线 表331胆碱的校准曲线参数(线性回归，权重系数为Y=1/C) 名称 线性范围(ug/L) 校准曲线 相关系数r 准确度(%) 胆碱 0.5-50 Y= (44546.4)X+(2456.64) 0.9994 85.1~106.6 2.4 精密度实验 配制如表4浓度的标液，重复进样7次。胆碱的保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在0.02~0.04%和0.47~1.42%之间，仪器精密度良好。 表41保留时间和峰面积重复性结果(n=7) No. RSD% (1ng/mL) RSD% (5ng/mL) RSD% (20 ng/mL) R.T. Area R.T. Area R.T. Area 1 1.105 42，635 1.104 211，867 1.105 834，705 2 1.106 43，276 1.104 213，675 1.105 842，504 3 1.105 42，062 1.104 213，926 1.104 841，990 4 1.105 43，259 1.104 215，962 1.104 845，052 5 1.105 43，068 1.104 212，518 1.104 845，397 6 1.105 42，875 1.104 210，977 1.104 839，072 7 1.104 41，709 1.104 213，371 1.104 845，309 平均值 1.105 42，698 1.104 213，185 1.104 842，004 RSD% 0.04 1.42 0.02 0.76 0.03 0.47 2.5灵敏度考察 对浓度为 0.1 ng/mL标样进样分析，以 ASTM 法计算噪声，以噪声的3倍作为检出限(即S/N=3)，以噪声的10倍作为定量限(即S/N=10)，则胆碱的检出限、定量限分别为 0.02 ng/mL、0.07 ng/mL。 图3 0.1ng/mL胆碱标液MRM图 2.6基质加标实验 对奶粉样品进行加标实验，加标浓度为10 ng/mL (94.8 mg/100 g) 及 40 ng/mL(379.2 mg/100 g)， 样品和每个浓度样品平行处理三份，考察回收率。测试结果显示：94.8和379.2mg/100 g加标回收率分别为94.2%和91.7%，相对标准偏差RSD%分别为在2.29%和6.50%；具体结果如表5。样品与羊品加标的色谱图如图4、图5所示。 根据 GB 5413.20-2013标准，试样中的胆碱以胆碱氢氧化物计，以毫克每百克(mg/100g) 表示，具体计算公式如下： 式中： 0.474---胆碱酒石酸氢盐转化为胆碱氢氧化物的系数。 图4奶粉样品的MRM图 图5奶粉基质加标样(94.8 mg/100 g)的MRM图 表5奶粉基质加标样的测试结果(n=3) No. 奶粉样品浓度 测定浓度(mg/100g)* 加标回收率(%) (mg/100g) 94.8 mg/100g 379.2 mg/100 g 94.8mg/100g 379.2mg/100 g 1 61.2 89.6 316.9 94.5 83.6 2 58.2 85.7 363.4 90.5 95.8 3 57.2 92.5 363.2 97.6 95.8 平均 58.9 89.3 347.8 94.2 91.7 RSD% 3.50 2.29 6.50 备注：“*”为扣除奶粉样品浓度后的测试浓度。 2.7婴幼儿奶粉的实际样品分析 选取3个品牌的婴幼儿奶粉样品按照1.3.2中样品制备方法，每个样品平行2个。具体结果如表6所示。 表63个品牌的奶粉样品测试结果 No. 品牌1(mg/100 g) 品牌2(mg/100 g) 品牌3(mg/100 g) 1 238.5 55.8 56.3 2 235.7 61.1 57.2 平均值 237.1 58.4 56.8 结论 使用岛津超高效液相色谱仪 Nexera-X2和三重四极杆质谱普 LCMS-8045联用测定婴幼儿乳制品中胆碱含量，在 0.5~50 ng/mL范围线性良好，相关系数均大于0.999；不同浓度的精密度实验结果表明：其保留时间和峰面积相对标准偏差分别在0.02~0.04%和0.47~1.42%之间，仪器精密度良好。考察了奶粉基质两个浓度的加标回收率在83.6~97.6%之间，从而验证了方法的准确度。然后对3种不同品牌的奶粉样品进行的实际分析。灵敏度考察得出胆碱的定量限为 0.07 ng/mL (1.4 mg/100 g)。低于 GB 5413.20-2013标准要求定量限为 5 mg/100 g。因此，该方法可以应用于婴幼儿奶粉中胆碱的快速分析。 田岛津企业管理(中国)有限公司分析中心 Shimadzu(China)CO.，LTD. Analytical Applications Center 参考《GB 5413.20-2013 食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中胆碱的测定》前处理，建立LCMS-8045联用测定婴幼儿乳制品中胆碱含量，在0.5 ~ 50 ng/mL范围线性良好，相关系数均大于0.999；不同浓度的精密度实验结果表明：其保留时间和峰面积相对标准偏差分别在0.02 ~ 0.04 %和0.47 ~ 1.42%之间，仪器精密度良好。考察了奶粉基质两个浓度的加标回收率在83.6 ~ 97.6%之间，从而验证了方法的准确度。然后对3种不同品牌的奶粉样品进行的实际分析。灵敏度考察得出胆碱的定量限为0.07 ng/mL (1.4 mg/100g)。低于GB 5413.20-2013 标准要求定量限为5 mg/100g。