血样中抗精神病药检测方案(液质联用仪)

SSL-CA14-894Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-377 http：//www.shimadzu.com.cn上海市徐汇区区州路180号B2栋咨询电话：021-34193996Hotline：021-34193996Building B2， No.180 Yizhou Road， Shanghai 利用CLAM-2000+LCMS-8060构建抗精神病药治疗药物监测定量分析方法 LCMSMS-377 摘要：本文使用岛津全自动在线前处理系统 CLAM-2000 和 LC-MS/MS 在线联用系统建立了血浆中11种中精神病药的全自动定量分析方法，整个实验流程不涉及手动前处理操作，减少了人为误差，提高分析的准确度。基质标曲不同浓度点准确度在93.5~105.6%之间，质控样本实测浓度在试剂盒说明书列出的允许波动范围内。 关键词： CLAM-2000 抗精神病药治疗药物监测前处理 治疗药物监测(Therapeutic drug monitoring， TDM)是临床药理学的重要研究内容之一，主要通过采用灵敏的现代分析测试手段来定量分析患者血液样本中的药物及其代谢产物的浓度，探讨血药浓度与药物疗效、毒性之间的关系，以确定药物有效浓度及毒性浓度之间的范围，并可根据药物动力学公式来计算最佳的治疗剂量，做到用药个体化，指导临床合理用药。 由于抗精神病药能产生十分严重的不良反应，在体内吸收不规则，个体差异大，易产生药物蓄积性中毒等。因此 TDM 在抗精神病类药物的临床使用中发挥了重要作用，通过对抗精神病药的监测，可以及时调整患者的用药方案，避免药物并发症等其他不良反应。 目前抗精神病药的 TDM 方法有薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)等。但是 TLC检测结果的假阳性高，HPLC 缺点是灵敏度低，在生物样本的定量分析过程中 有一定的局限性， LC-MS/MS因具有高灵敏度、检出限低的特点，，可以进行多组分定性、定量检测。 为了提高临床检验工作效率，减少人力成本，目前医院和第三方医学检验单位都在寻求一种样本全自动在线前处理设备。岛津中国今年推出的 CLAM-2000自动化生物样本前处理系统可以极大地提高了工作效率和自动化程度，减少了人为误差；减少分析人员接触生物样本机会，降低生物感染的风险；与LC-MS/MS自动连接，提高效率。 本文基于抗精神病药商品化试剂盒，使用岛津全自动在线前处理设备 CLAM-2000 和 LC-MS/MS联用系统建立了11种抗精神病药的定量分析方法，整个实验流程不涉及手动前处理操作，减少了人为误差，提高分析的准确度。该方法方便、快捷，实现了11抗精神病药的同时快速分析，供相关人员参考。 1.1仪器 本实验使用全自动在线前处理系统 CLAM-2000、岛津超高效液相色谱仪LC-30A、三重四极杆质谱仪 LCMS-8060联用系统。具体配置为 LC-30AD×2输液泵，DGU-20A5R在线脱气机， SIL-30AC 自动进样器， CTO-20AC柱温箱，CBM-20A 系统控制器， LCMS-8060三重四极杆质谱仪， CLAM-2000 软件 CLAM-2000_PC_V1_13， LabSolutionsVer. 5.91 SP1 色谱工作站。 1.2试剂盒信息 名称： TDM series A PARAMETER Set Neuroleptics 1 in Serum/Plasma(以下简称 Neuroleptics 1) 品牌：德国Chromsystems 组成：血浆基质标品、血浆基质质控、内标、稀释剂、提取试剂、蛋白沉淀剂、色谱柱 1.3分析条件 液相条件 色谱普：试剂盒 Neuroleptics 1提供柱温：30℃流动相：A相-0.1%甲酸水溶液进样量：0.5uLB 相-0.1%甲酸乙腈洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为20%，时间程序见表1 流速：0.6mL/min 表1梯度洗脱程序 Time(min) Module Command Value 0.20 泵 B.Conc 20 0.21 泵 B.Conc 50 0.70 泵 B.Conc 50 0.71 泵 B.Conc 70 2.30 泵 B.Conc 70 2.31 泵 B.Conc 20 3.00 控制器 Stop 表2 MRM参数 Q1 Pre CE Q3 Pre 化合物名 Name CAS号 m/z Bias (V) Bias (V) (V) 448.10>285.15* -30 -26 -14 阿立哌唑 Aripiprazole 129722-12-9 448.10>176.15 -15 -32 -18 5786-21-0 327.10>270.10* -24 -21 -29 氯氮平 Clozapine 327.10>192.15 -11 -43 -13 脱氢阿立哌 129722-25-4 446.10>285.15* -20 -23 -29 唑 Dehydroaripiprazole 446.10>98.15 -11 -41 -10 6104-71-8 313.10>192.10* -21 -39 -30 去甲氯氮平 Desmethylclozapine 313.10>270.10 -14 -23 -13 氟哌啶醇 Haloperidol 52-86-8 376.10>165.15* -26 -23 -30 376.10>165.15 -28 -40 -22 去甲奥氮平 299.10>256.15* -21 -23 -27 N-Desmethylolanzapine 161696-76-0 299.10>198.10 -30 -37 -21 11-(1-哌嗪 296.10>210.10* -21 -29 -22 基)二苯并 Norquetiapine 5747-48-8 [B，F][1，4] 硫氮杂卓 296.10>183.10 -10 -41 -19 奥氮平 132539-06-1 313.10>256.15* -22 -23 -27 Olanzapine 313.10>198.05 -23 -42 -20 喹硫平 384.10>253.10* -29 -23 -26 Quetiapine 111974-69-7 384.10>221.15 -10 -38 -15 利培酮 Risperidone 106266-06-2 411.20>191.15* -14 -29 -20 411.20>110.30 -19 -48 -20 9-羟基利培 9-0H-Risperidone 144598-75-4 427.20>207.15* -30 -27 -22 酮 427.20>110.15 -11 -42 -11 316.10>256.15* -25 -21 -28 Olanzapine IS 奥氮平 316.10>198.10 -22 -41 -20 氟哌啶醇内 382.10>123.00* -13 -40 -12 标 Haloperidol IS 382.10>123.00 -30 -26 -28 335.10>275.10* -25 -23 -29 氯氮平内标 Clopazine IS 335.10>192.10 -11 -46 -12 阿立哌唑内 456.10>293.15* -22 -27 -25 标 Aripiprazole IS 456.10>177.90 -30 -29 -22 去甲奥氮平 307.10>198.10* -21 -35 -21 内标 N-Desmethylolanzapine IS 307.10>261.15 -22 -25 -17 9-羟基利培 431.10>211.20* -30 -29 -22 酮内标 9-0H-Risperidone IS 431.10>114.15 -11 -44 -12 415.20>195.20* -30 -28 -20 利培酮内标 Risperidone IS 415.20>114.20 -14 -50 -22 388.10>255.15* -28 -23 -27 喹硫平内标 Quetiapine IS 388.10>223.20 -28 -40 -23 去甲氯氮平 Desmethtylclopazine IS 321.10>192.15* -23 -41 -30 内标 321.10>275.10 -24 -24 -29 11-(1-哌嗪 304.10>210.10* -22 -30 -22 基)二苯并 Norquetiapine IS B，F[1，4] 硫氮杂卓内 304.10>183.10 -21 -41 -12 标 脱氢阿立哌 Dehydroaripiprazole IS 454.10>293.10* -15 -25 -20 唑内标 454.10>102.20 -30 -42 -20 注：*表示定量离子 1.4 CLAM-2000前处理程序 在 CLAM-2000 控制软件界面 KIT.Cond 菜单的子菜单 protocol 项下，编辑样品自动前处理程序，具体步骤为(1)、在过滤管中加入20 uL甲醇活化过滤管，准备上样； (2)、吸取血浆样品25uL上样； (3)、加入提取盐溶液12.5 uL； (5)、转速2000 rpm 振荡60秒； (4)、试剂针吸取125uL蛋白沉淀剂(含内标)； (5)、转速1000 rpm震荡90秒；(6)、使用-50~-60 kPa 的负压抽滤过滤管120秒，转移至液相自动进样器进样0.5uL(详见图1)。 图1 CLAM-2000自动前处理流程 结果与讨论 本实验采用岛津生物样本全自动在线前处理系统 CLAM-2000 进行血浆样品的前处理，样品处理结束后会自动将样品输送到 LC-MS/MS 的自动进样器单元进行进样分析。参照试剂盒 Neuroleptics 1中手动前处理流程，本文中样品自动前处理程序包括吸取样品、吸取提取盐溶液、振摇、吸取蛋白沉淀剂(包含内标))、振摇和过滤，总时间约6 min， 在LC-MS/MS 进行分析的同时，自动前处理程序也在同时进行，并且 CLAM-2000会根据前处理流程同时处理2-3个样品，即有的样品在进行样品吸取，有的样品在进行振摇，有的样品在进行抽滤等。这种交叉处理样本的行为使得每个样品的LC-MS/MS 分析时间间隔为 5 min (小于整个样本处理时间，如图2所示)。 图2 CLAM-2000和LCMS-8060联用工作模式 2.1基质标准品色谱图 2.0- 1.0- 3.0- 2.0- 图211种抗精神病药定量下限色谱图 2.2线性范围 Neuroleptics1试剂盒中各级别基质标品浓度和线性回归各浓度的准确度如表3所示，按1.4的自动前处理程序和1.3中的分析条件进行分析检测，利用内标法制作校准曲线，线性良好，线性方程、相关系数见图3. 表311种抗精神病药基质标曲浓度范围和标线准确度 Compounds 基质标曲浓度(ng/mL)准确度(%) Calibrator1 Calibrator2 Calibrator3 Aripiprazole 20.6 269 746 93.5~104.3 Clopazine 77.7 440 1149 96.6~102.3 Dehydroaripiprazole 7.56 97 273 99.9~100.2 Desmethtylclopazine 75.1 200 453 96.6~102.3 Haloperidol 2.03 16.1 30.3 97.6~104.7 N-Desmethylolanzapine 3.92 55.4 160 94.1~104.0 Norquetiapine 10.4 80.7 221 96.2~102.5 Olanzapine 3.85 54.1 153 91.6~105.6 Quetiapine 27.3 201 525 95.2~103.1 Risperidone 2.04 12.1 30.7 97.9~101.3 9-OH-Risperidone 3.68 49.5 138 97.4~101.7 图311种抗精神病药基质标曲相关信息 2.3质控样品检测结果 试剂盒 Neuroleptics 1提供2个不同浓度质控样品 QC1和QC2，标示浓度和允许波动范围如表4所示，实际检测浓度在允许波动范围内(表4)。 表44加质控样品检测结果 化合物 标示浓度 (ng/mL) 允许波动范围 (ng/mL) 实测浓度 (ng/mL) QC1 QC2 QC1 QC2 QC1 QC2 Aripiprazole 185 336 148-222 269-403 203.15 360.24 Clopazine 325 544 260-390 435-653 368.61 497.44 Dehydroaripiprazole 67.1 125 53.6-80.5 100-150 75.46 132.28 Desmethtylclopazine 166 234 133-199 187-280 183.27 257.22 Haloperidol 4.03 17.9 3.22-4.83 14.3-21.4 4.62 17.75 N-Desmethylolanzapine 39.8 72.3 31.8-47.7 57.8-86.7 42.55 77.50 Norquetiapine 58.2 101 46.5-69.8 80.6-121 62.30 101.06 Olanzapine 37.9 68.6 30.3-45.4 54.9-82.4 41.88 68.37 Quetiapine 148 244 118-177 195-292 166.12 234.21 Risperidone 9.1 14.3 7.28-10.9 11.5-17.2 9.93 14.14 9-OH-Risperidone 33.6 61 26.9-40.3 48.8-73.3 35.78 66.37 结论 本文使用岛津全自动在线前处理设备 CLAM-2000 和 LC-MS/MS 在线联用系统，建立了人血浆种11种抗精神病药的定量分析方法，整个实验流程不涉及手动前处理操作，从吸取样品、提取试剂、沉淀剂，到样品混匀、过滤，以及将处理完的样品输送到 LC-MS/MS 自动进样器均靠仪器自动完成，减少了人为误差，提高分析的准确度，适合临床样本抗精神病药的快速定量检测。本实验中基质标曲不同浓度点准确度在93.5~105.6%之间，质控样本实测浓度在试剂盒说明书列出的允许波动范围内。 岛津企业管理(中国)有限公司分析中心Shimadzu(China)CO.，LTD. Analytical Applications Center 本文使用岛津全自动在线前处理设备CLAM-2000和LC-MS/MS在线联用系统，建立了人血浆种11种抗精神病药的定量分析方法，整个实验流程不涉及手动前处理操作，从吸取样品、提取试剂、沉淀剂，到样品混匀、过滤，以及将处理完的样品输送到LC-MS/MS自动进样器均靠仪器自动完成，减少了人为误差，提高分析的准确度，适合临床样本抗精神病药的快速定量检测。本实验中基质标曲不同浓度点准确度在93.5～105.6%之间，质控样本实测浓度在试剂盒说明书列出的允许波动范围内。