利用岛津现有的“细胞培养上清液分析方法包“直接分析监测细胞上清液中组分变化,无需方法优化,并可快速实现方法拓展,前处理方便,数据分析结果直观。
SSL-CA14-748Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-359 http://www.shimadzu.com.cn上海市徐汇区宜州路180号华鑫天地二期C801栋Building C801, No.180 Yizhou Road, ShanghaiHotline:021-34193996 细胞培养上清液分析技术在抗体生产细胞培养工艺筛选中的应用 LCMSMS-359 摘要:本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8060联用同时测定细胞培 养上清液中95种组分,快速分析了用于抗体生产的4种培养工艺中95种化合物的相对含量变化趋势,从而判断细胞培养工艺的可行性并发现影响抗体产量和质量的关键因素。该方法在17 min 内完成95种化合物的分离,分析速度快、重复性好、灵敏度高,适合细胞培养上清液中糖类、氨基酸类、核苷类和维生素类化合物的高灵敏度快速检测。 关键词:超高效液相色谱仪三重四极杆质谱仪细胞培养工艺 抗体是机体体液免疫关键效应分子,同时还能辅助细胞免疫和补体系统,近年来随着杂交瘤技术、噬菌体文库技术、细胞大规模培养技术等的迅猛发展,抗体已经可以在体外大规模生产,因其特异性强、治疗效果显著等特点,抗体已被广泛用于人类疾病的诊断、预防和治疗。在抗体生产过程中,为了提高抗体的质量和产量,需要对培养基、培养工艺进行优化,并考虑生产的线性放大等等。要实现培养基和培养工艺的优化,需要实时监控抗体生产过程中细胞培养上清液中关键因素的变化,从而得出最优化培养基和培养工工。 为满足快速全面分析细胞培养上清液组分,将基础 碳源、氮源、核苷酸、维生素和其他主要代谢物一起检测分析,得到更多有关生物过程中的详细信息,我们开发出“细胞培养分析方法包”。该技术平台采用超高效液相色谱三重四极杆液质联用仪,仅需17分钟,即可同时监测分析95种细胞培养上清液营养成份和代谢物的相对丰度变化。 本文使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱LCMS-8060联用,利用“细胞培养分析方法包”建立了不同细胞培养工艺中营养物质和细胞代谢物的液相色谱-串联质谱的同时分析方法,供相关人员参考。 1.1仪器 本实验使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A与三重四极杆质谱仪LCMS-8060 联用系统。具体配置为:LC-30AD×2输液泵, DGU-20A 在线脱气机, SIL-30AC自动进样器, CTO-20AC 柱温箱, CBM-20A系统控制器,LCMS-8050 三重四极杆质谱仪, LabSolutions Ver. 5.80 色谱工作站。 1.2分析条件 液相色谱条件 时间程序:见“细胞培养分析方法包” 分析仪器: LC-30A系统进样体积:1uL色谱柱:见“细胞培养分析方法包”柱温:40℃流动相:见“细胞培养分析方法包”洗脱方式:梯度洗脱流速:0.35mL/min质谱条件分析仪器:LCMS-8060脱溶剂管温度: 250℃离子源:ESI,正负离子同时扫描加热模块温度: 400C离子源接口电压:+4.0kV;-3.0kV接口温度:300℃雾化气:氮气3.0 L/min扫描模式:多反应监测则(MRM)干燥气:氮气15 L/min驻留时间:2.0-5.0 ms加热气:空气10 L/minMRM参数:见“细胞培养分析方法包”碰撞气:氩气化合物:见表1 1.4样品制备 样品前处理方法:取500uL细胞培养液,在室温下离心1分钟(3000rpm), 吸取 100 uL离心后上清液到新的离心管中,然后加入20uL2-异丙基苹果酸内标溶液(0.5mmol/L),再加入200 uL乙腈,旋旋使充分混匀,室温下离心15分钟(15000rpm),精密吸取上清液100 uL, 加入900L水, 涡旋混匀,上机前再用纯水稀释100倍。 表1细胞培养方法包中96种化合物列表 编号 化合物名 类别 编号 化合物名 类别 编号 化合物名 类别 1 2-Isopropylmalic acid 内标 33 N-Acetylaspartic acid 氨基酸 65 Cytidine 核苷酸 2 Gluconic acid 糖类 34 N-Acetylcysteine 氨基酸 66 Cytidine monophosphate 核苷酸 3 Glucosamine Carbohydrate 糖类 35 Ornithine 氨基酸 67 Deoxycytidine 核苷酸 4 Hexose (Glucose) Carbohydrate 糖类 36 Oxidized glutathione 氨基酸 68 Guanine 核苷酸 5 Sucrose Carbohydrate 糖类 37 Phenylalanine 氨基酸 69 Guanosine 核苷酸 6 Threonic acid Carbohydrate 糖类 38 Pipecolic acid 氨基酸 70 Guanosine monophosphate 核苷酸 7 2-Aminoadipic acid 氨基酸 39 Proline 氨基酸 71 Hypoxanthine 核苷酸 8 4-Aminobutyric acid 氨基酸 40 Serine 氨基酸 72 Inosine 核苷酸 9 4-Hydroxyproline 氨基酸 41 Threonine 氨基酸 73 Thymidine 核苷酸 10 5-Glutamylcysteine 氨基酸 42 Tryptophan 氨基酸 74 Thymine 核苷酸 11 5-Oxoproline 氨基酸 43 Tyrosine 氨基酸 75 Uracil 核苷酸 12 Alanine 氨基酸 44 Valine 氨基酸 76 Uric acid 核苷酸 13 Alanyl-glutamine 氨基酸 45 4-Aminobenzoic acid 维生素 77 Uridine 核苷酸 14 Arginine 氨基酸 46 Ascorbic acid 维生素 78 Xanthine 核苷酸 15 Asparagine 氨基酸 47 Ascorbic acid 2-phosphate 维生素 79 Xanthosine 核苷酸 16 Aspartic acid 氨基酸 48 Biotin 维生素 80 Penicillin G 抗生素 17 Citrulline 氨基酸 49 Choline 维生素 81 2-Aminoethanol 其他 18 Cystathionine 氨基酸 50 Cyanocobalamin 维生素 82 2-Ketoisovaleric acid 其他 19 Cysteine 氨基酸 51 Ergocalciferol 维生素 83 3-Methyl-2-oxovaleric acid 其他 20 Cystine 氨基酸 52 Folic acid 维生素 84 4-Hydroxyphenyllactic acid 其他 21 Glutamic acid 氨基酸 53 Folinic acid 维生素 85 Citric acid 其他 22 Glutamine 氨基酸 54 Lipoic acid 维生素 86 Ethylenediamine 其他 23 Glutathione 氨基酸 55 Niacinamide 维生素 87 Fumaric acid 其他 24 Glycine 氨基酸 56 Nicotinic acid 维生素 88 Glyceric acid 其他 25 Glycyl-glutamine 氨基酸 57 Pantothenic acid 维生素 89 Histamine 其他 26 Histidine 氨基酸 58 Pyridoxal 维生素 90 Isocitric acid 其他 27 Isoleucine 氨基酸 59 Pyridoxine 维生素 91 Lactic acid 其他 28 Kynurenine 氨基酸 60 Riboflavin 结果与讨论 2.1体体生产细胞培养上清液分析色谱图 使用“细胞培养分析方法包”中的方法对不同培养工艺的细胞培养上清液中组分进行分析,目标组分不同程度被检出,色谱图如图1所示。 图1F1-D3细胞培养上清液组分分析色谱图 2.2用于抗体生产的4种细胞培养工艺中部分糖、氨基酸、核苷和维生素类化合物的含量变化趋势 以下各柱形图均以培养时间为横坐标,目标化合物与内标化合物的峰面积比为纵坐标进行绘图。 2.2.1糖类化合物 图2用于抗体生产的4种细胞培养工艺中部分糖类化合物的相对含量变化趋势 用于抗体生产的4个不同细胞培养工艺中,葡萄糖 (Glucose)的相对浓度基本维持在相当水平,变化幅度很小。葡萄糖酸 (Gluconic acid) 和苏糖酸 (Threonic acid)的相对含量比较低,且在F1培养工艺中苏糖酸 (Threonicacid) 的相对含量随着培养时间的增加而增加,趋势明显。 2.2.2氨基酸类化合物 寸 m m m 寸 图3用于抗体生产的4种细胞培养工艺中部分氨基酸类化合物的相对含量变化趋势 Glutamine 4 2 1 0 样品名名: 在4个不同的细胞培养工艺中,谷氨酰胺 (Glutamine) 消耗量比较大,在最后2天的培养过程中几乎耗尽,可根据目标产物的要求适当调整该氨基酸的添加量;丙氨酸 (Alanine)随着培养时间的增加相对浓度逐渐变大,初步推断是细胞摄入过多葡萄糖,生成代谢废物丙氨酸;鸟氨酸(Ornithine) 在培养过程中基本保持一个稳定浓度,变化微小,可结合最终抗体产物的质量和产量来适当调整该化合物的平衡浓度。 2.2.3 核苷类化合物 图4用于抗体生产的4种细胞培养工艺中部分核苷类化合物的相对含量变化趋势 在4个不同的培养工艺中,核苷类化合物均随着培养时间的增加而增加,培养基中均不含这4个核苷类化合物。 2.2.4维生素类化合物 图5用于抗体生产的4种细胞培养工艺中部分维生素类化合物的相对含量变化趋势 在4个不同培养工艺中生物素(Biotin)和叶酸 (Folic acid)的相对浓度在5天的培养过程中维持在一定水平,而维生素B6 (Pyridoxine) 随着培养时间的增加,相对浓度逐八减小,可对其浓度进行适当调整,从而保证目标抗体最终的质量和产量符合要求。 采用岛津公司 LCMS-8060 三重四极杆液质联用仪,结合“细胞培养分析方法包”快速分析了用于抗体生产的4种培养工艺中95种化合物的相对含量,并对4个细胞培养工艺中部分糖类、氨基酸类、核苷类和维生素类化合物随着培养时间的变化趋势进行了详细说明,结合抗体生产的质量和产量要求,选择高效快速的培养工艺,并发现影响抗体产量和质量的关键因素,该方法可为细胞培养工艺的选择和优化提供直接可靠的依据。 岛津企业管理(中国)有限公司分析中心Shimadzu(China)CO.,LTD. Analytical Applications Center 采用岛津公司 LCMS-8060 三重四极杆液质联用仪,结合“细胞培养分析方法包”快速分析了用于抗体生产的4种培养工艺中95种化合物的相对含量,并对4个细胞培养工艺中部分糖类、氨基酸类、核苷类和维生素类化合物随着培养时间的变化趋势进行了详细说明,结合抗体生产的质量和产量要求,选择高效快速的培养工艺,并发现影响抗体产量和质量的关键因素,该方法可为细胞培养工艺的选择和优化提供直接可靠的依据。
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