福尔马林固定石蜡包埋组织及新鲜冷冻组织中DNA 质量控制检测方案(生物芯片)

靶向序列捕获和新一代测序前对福尔马林固定石蜡包埋组织及新鲜冷冻组织进行 DNA质量控制 应用简报 核酸分析 作者 Melissa Huang Liu 安捷伦科技有限公司 美国加利福尼亚州拉霍亚 Maria Celeste Ramirez 安捷伦科技有限公司 美国加利福尼亚州圣克拉拉 摘要 本文将介绍利用Agilent 2100 生物分析仪系统的微流控芯片电泳，在新一代测序工作流程的SureSelect 靶向序列捕获之前或期间，对福尔马林固定石蜡包埋组织及新鲜冷冷组织的DNA样品进行质量控制。借助2100生物分析仪系统可靠的 DNA电泳技术，可提供弥散条带谱及详细的文库统计信息，例如峰高、平均弥散条带分子量、分子量分布和 DNA 浓度。 FFPE DNA 样品的结果与新鲜冷冻组织和对照 DNA的 DNA分析结果具有可比性。 前言 最常用的临床样品保存和存档方法之一是制备福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织。全世界的组织库、医院及实验室内存档的 FFPE组织样本数超过4亿个。组织样本通过解剖或活检进行收集，然后用福尔马林固定以及石蜡包埋以保持其完整性，用于组织病理学研究及显微镜观察。收集到的这些病变组织和正常组织未来可能会成为分子遗传学研究中非常有价值的资源。但是， 从FFPE 样品中进行 DNA提取面临巨大的挑战。甲醛交联、降解以及单链和双链 DNA 相混合等常见问题会导致适合下游应用的 DNA材料数量减少。因此，对用于新一代测序 (NGS)等高灵敏度、成本高昂的应用的样品进行质量评估显得尤为重要。 经验证，2100生物分析仪是 NGS 工作流程中进行片段 DNA 和 DNA 文库分子量测定以及定量分析的一个重要工具。本文将介绍利用2100生物分析仪的芯片电泳技术对 NGS 靶向序列捕获工作流程中的FFPE和新鲜冷冻 DNA 样品进行分析。 实验部分 材料 FFPE 及新鲜冷冻组织的 DNA 由西奈山医学院捐赠(美国纽约州纽约市)，NA10831-1对照 DNA购自科里尔研究所(美国新泽西州卡姆登)。QIAmp DNAFFPE 组织式剂盒购自QIAGEN GmbH(德国希尔登)。 Ambion RecoverAll总核酸分离试剂盒购自 Life Technologies 公司(美国加利福尼亚州州尔斯巴德)。E220样品前处理系统购自 Covaris 公司(美国马萨诸塞州沃本)。2100生物分析仪、安捷伦 DNA 1000试剂盒，以及安捷伦高灵敏度 DNA试剂盒均来自安捷伦科技有限公司(德国瓦尔特布隆)。 样品前处理 采用 QIAGEN FFPE 组织试剂盒及 Ambion核酸分离试剂盒提取病人 FFPE 肿瘤组织中的基因组 DNA。所有样品均采用SureSelect 靶向序列捕获实验方案进行进一步处理。 采用芯片电泳进行 DNA 质量控制 DNA 电泳采用了2100生物分析仪，并根据生产商的实验方案4.5， 联用 DNA 1000试剂盒或高灵敏度 DNA试剂盒。并在区域 (Region) 表格中对弥散条带的浓度及平均分子量进行分析。峰高在色谱峰(Peak)表格中进行测定，如SureSelect 实验方案中所述。 结果和讨论 要想成功实现靶向序列捕获和NGS， 关键是在样品前处理工作流程中的特定时间点对样品质量进行评估。在本文中，源自病人FFPE组织的基因组 DNA (gDNA)、新鲜冷冻肿瘤组织中相匹配的gDNA，以及对照细胞系 DNA 均根据 SureSelect 实验方案进行处理。利用2100生物分析仪在一些关键步骤进行 DNA样品质量控制(QC)：剪切后片段化、捕获前扩增及捕获后扩增(图1)。 图1 SureSelect 靶向序列捕获的样品前处理工作流程。需要 DNA QC 的步骤以红色框标识(A：剪切后， B：捕获前扩增， C：捕获后扩增) 剪切后片段化分析 源自FFPE 样品的 DNA 采用两种不同的方法进行提取— QIAGEN FFPE组织试剂盒(FFPE DNA Q) 和 Ambion 核酸分离试剂盒 (FFPE DNA A)， 并与相匹配的新鲜冷冻组织提取的 DNA 及对照 DNA进行比较。所有样品均采用 Covaris 系统进行片段化。剪切后样品采用 DNA 1000 试剂盒分析(图2)，结果显示各样品均出现100至450碱基的弥散条带。除了分子量及纯度信息外，2100生物分析仪还可提供每个样品的总DNA浓度，并对特定区域内的弥散条带定量。 图3 使用 Agilent 2100 生物分析仪及安捷伦 DNA 1000 试剂盒分析所得的捕获前扩增样品的电泳叠加谱图。样品： FFPE DNAQ(红色) ， FFPEDNAA(蓝色)，新鲜冷冻组织DNA(绿色)， 对照 DNA(浅绿色) 样品 平均分子量[bp] 峰高[bp] 浓度[ng/pL] FFPE DNA Q 307 264 34.8 FFPE DNAA 309 254 22.6 冷冻组织 DNA 331 264 89.5 对照 DNA 348 271 23.2 表1 捕获前扩增文库的平均分子量、峰高及定量 捕获前扩增 四个 DNA样品按照样品前处理工作流程(图1)进行进一步处理。对捕获前扩增样品进行五次PCR循环，然后采用 DNA 1000试剂盒在2100生物分析仪上进行分析(图3)。 所有 DNA 样品的谱图在大约100至900碱基之间十分类似。平均分子量为307至348碱基之间，最大峰高位于254至271碱基之间(表1)。未观察到任何扩增假体或引物二聚体。此外，2100生物分析仪可自动提供弥散条带的 DNA 浓度， 其介于23至90 ng/pL 之间。 捕获后扩增 SureSelect 实验方案中的最后一个DNAQC步骤需要对捕获后样品进行10次循环扩增，然后采用高灵敏度 DNA试剂盒在2100生物分析仪上进行分析(图4)。观察结果表明，所有四个样品的电泳谱图较为一致，弥散条带从225至600碱基，峰高为314至336碱基(表2)。分子量分布及 DNA 文库的产量均在 Illumina 末端配对多重测序所推荐的范围之内(2×76bp读长)。 结论 在 SureSelect 靶向序列捕获的样品前处理工作流程中，2100生物分析仪被应用于 FFPE 样品的 NGS样品 QC。可靠的DNA芯片电泳可提供弥散条带谱和详细的文库统计信息，例如峰高、平均弥散条带分子量、分子量分布和 DNA 浓度。FFPE、相匹配的新鲜冷冻组织，以及对照细胞系DNA所得结果适用于下游的Illumina 平台测序。 图4 使用Agilent 2100生物分析仪系统及高灵敏度DNA试剂盒分析所得的捕获后扩增文库的电泳叠加谱图。样品： FFPE DNA Q(红色)， FFPE DNA A(蓝色)，新鲜冷冻组织DNA(绿色)， 对照 DNA(浅绿色) 样品 平均分子量[bp] 峰高[bp] 浓度 [pg/pL] FFPE DNA Q 357 316 572.0 FFPE DNA A 348 314 609.4 冷冻组织DNA 376 340 676.3 对照 DNA 382 336 415.2 ( 参考文献 ) 1. Tang， W.， David， F. B.， Wilson， M. M.， ( Barwick， B. G .，Leyland-Jones， B. R.， ) ( and Bouzyk， M. M.，"DNA Extraction ) from Formalin-Fixed， Paraffin-Embedded Tissue"， Cold Spring Harbor Protocols， doi：10.1101/pdb.prot5138，2009. 2. Kirill Gromadski， Rudiger Salowsky， Susanne Gluck，"Improving sample quality for SureSelect target enrichment and next-generation sequencing with the Agilent High Sensitivity DNA kit" (采用安捷伦高灵敏度 DNA 试剂盒提高 SureSelect 靶向序列捕获及新一代测序的 样品质量)，安捷伦科技应用简报，出版 号5990-5008EN， 2010 3. "SureSelect Target Enrichment System for Illumina Paired-End Sequencing" ( (适用于 Illumina 末端配对测序的 ) SureSelect靶向序列捕获系统)，安捷 伦科技操作手册，出版号 G7530-90000， 2012 ( 4. ) "Agilent High Sensitivity DNA Kit Guide" (安捷伦高灵敏度 DNA试剂盒指南)， 安 ( 捷伦科技操作手册，出版号 G2938-90321， ) 2009 5. ( "Agilent DNA 1000 Kit Guide" (安捷伦 ) ( DNA 1000试剂盒指南)，安捷伦科技操 ) ( 作手册，出版号 G2938-90014， 2006 ) www.agilent.com/genomics/bioanalyzer @安捷伦科技(中国)有限公司，2012 2012年6月1日，中国出版 5991-0483CHCN Agilent Technologies Agilent Technologies 摘要本文将介绍利用 Agilent 2100 生物分析仪系统的微流控芯片电泳，在新一代测序工作流程的 SureSelect 靶向序列捕获之前或期间，对福尔马林固定石蜡包埋组织及新鲜冷冻组织的 DNA 样品进行质量控制。借助 2100 生物分析仪系统可靠的 DNA 电泳技术，可提供弥散条带谱及详细的文库统计信息，例如峰高、平均弥散条带分子量、分子量分布和 DNA 浓度。FFPE DNA 样品的结果与新鲜冷冻组织和对照 DNA 的 DNA 分析结果具有可比性。前言最常用的临床样品保存和存档方法之一是制备福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 组织。全世界的组织库、医院及实验室内存档的 FFPE 组织样本数超过 4 亿个。组织样本通过解剖或活检进行收集，然后用福尔马林固定以及石蜡包埋以保持其完整性，用于组织病理学研究及显微镜观察。收集到的这些病变组织和正常组织未来可能会成为分子遗传学研究中非常有价值的资源。但是，从 FFPE 样品中进行 DNA 提取面临巨大的挑战。甲醛交联、降解以及单链和双链 DNA 相混合等常见问题会导致适合下游应用的 DNA 材料数量减少。因此，对用于新一代测序 (NGS) 等高灵敏度、成本高昂的应用的样品进行质量评估显得尤为重要。经验证，2100 生物分析仪是 NGS 工作流程中进行片段 DNA 和 DNA 文库分子量测定以及定量分析的一个重要工具。本文将介绍利用 2100 生物分析仪的芯片电泳技术对 NGS 靶向序列捕获工作流程中的 FFPE 和新鲜冷冻 DNA 样品进行分析。结论在 SureSelect 靶向序列捕获的样品前处理工作流程中，2100 生物分析仪被应用于 FFPE 样品的 NGS 样品 QC。可靠的 DNA 芯片电泳可提供弥散条带谱和详细的文库统计信息，例如峰高、平均弥散条带分子量、分子量分布和 DNA 浓度。FFPE、相匹配的新鲜冷冻组织，以及对照细胞系 DNA 所得结果适用于下游的 Illumina 平台测序。 扫描下方二维码，关注“安捷伦视界”微信公众号，获取更多解决方案资讯。