人血清中维生素A和维生素E检测方案(液质联用仪)

SSL-CA14-706Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-347 岛津全球应用技术开发支持中心上海市徐汇区宜州路180号华鑫天地二期C801栋 咨询电话：021-34193996http：//www.shimadzu.com.cn Nexera MX 平行液谱色谱质谱联用系统测定人血清中的 VA 和 VE 含量 LCMSMS-347 摘要：本文使用使津 Nexera MX 平行液相色谱质谱联用系统，建立了人血清中VA 和 VE 含量测定方法。样品经液液萃取处理后，采用该系统在 3.5 min 内完成目标物分析。VA、VE 在 0.05~5.0 ugmL和 0.5~50 ugmL浓度范围内线性良好，相关系数分别为 0.9992 和0.9995。并通过2例实际血清品品，考察方法稳定性，检测结果CV%均小于5.0%。该方法具有分析速度快、重复性好的特点，可为临床中人血清中VA、VE 的快速筛查提供良好借鉴和参考。 关键词： Nexera MX 平行液相三重四极杆质谱仪血清 VA VE 维生素A(VA)和维生素 E(VE)是一类脂溶性维生素，在人体内有着重要的生理功能。其中VA具有维持暗视觉作用、维持和增强免疫功能、抑制肿瘤细胞生长的作用；VE则具有抗脂质过氧化、维持生殖机能等作用。VA 和 VE 的缺乏将导致代谢异常，严重影响机体健康。因此，准确测定血清中 VA、VE的含量，对预防、诊断和治疗 VA、VE缺乏有非常重要意义。 本文使用岛津 Nexera MX 平行液相色谱质谱联用系 实验部分 统，建立了人血清中VA 和 VE含量测定方法。与常规液质联用方法相比，Nexera MX 系统在保证方法精密度与稳定性的基础上，通过交替平行进样分析，有效节省样品分析过程中冲洗系统、色谱柱平衡、自动进样器进样等分析时间，大大提升了 LCMS 处理速度与样品分析速率。通过 Nexera MX 平行液相色谱质谱联用系统开发的人血清中VA 和VE 含量测定方法，可实现VA、VE高通量快速筛查。 1.1化合物信息 表1化合物信息 化合物名称 英文名 CAS No. 分子式 结构式 VA Vitamin A 68-26-8 C20H30O OH VE Vitamin E 10191-41-0 C29H50O2 H VA-d5(IS) Vitamin A-ds C20H25D5O VE-d6 (IS) Vitamin E-d6 一 C29H44D6O2 1.2仪器 本实验使用岛津 Nexera MX 超高效平行液相与三重四极杆质谱仪LCMS-8060 联用系统。具体配置为 LC-30ADx4输液泵， DGU-20AsRx2在线脱气机， SIL-30ACMP 自动进样器， CTO-20AC 柱温箱， CBM-20A 系统控制器，LCMS-8060 三重四极杆质谱仪， LabSolutions Ver. 5.91 色谱工作站。 1.3仪器结构及原理 1.4分析条件 液相条件 色谱柱： Shim-pack GIST C18)2.1 mm I.D.x50 mm L.，2.0 um) 进样量：1uL 流动相：A相-水(含0.1%甲酸)B相-甲醇(含0.1%甲酸) 流速：0.4mL/min 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为88%，洗脱程序见表2、表3。(表4为常规液相梯度洗脱程序，B相初始浓度为88%，两系统液相梯度曲线图见图1、图2。) 柱温：40℃ 表2分析流路梯度洗脱程序 Time(min) Module Command Value 0.00 Pumps Pump B Conc. 88 0.60 Pumps Pump B Conc. 88 0.61 Pumps Pump B Conc. 98 3.50 Controller Stop 表3冲洗平衡流路梯度洗脱程序 Time(min) Module Command Value 0.00 Pumps Pump B Conc. 88 2.50 Controller Stop 表4常规液相梯度洗脱程序 Time(min) Module Command Value 0.60 Pumps Pump B Conc. 88 0.61 Pumps Pump B Conc. 98 3.50 Pumps Pump B Conc. 98 3.51 Pumps Pump B Conc. 88 6.00 Controller Stop 图1MX系统液相梯度曲线图 图221常规液相梯度曲线图 质谱条件 分析仪器： LCMS-8060 接口温度：300℃ 离子化模式： ESI(+) DL温度：250℃ 离子源接口电压：4.0kV 加热模块温度：400℃ 雾化气：氮气3.0L/min 扫描模式：多反应监测(MRM) 加热气：空气10.0L/min 驻留时间：22ms 干燥气：氮气10.0 L/min 延迟时间： 3ms 碰撞气：氩气 MRM参数：见表5 表5 MRM优化参数 名称 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias (V) CE (V) Q3 Pre Bias (V) VA 269.15 213.15* -13.0 -14.0 -20.0 93.10 -13.0 -22.0 -15.0 VE 431.20 165.10 -21.0 -21.0 -15.0 137.05 -21.0 -41.0 -11.0 VA-ds 274.15 218.20 -13.0 -14.0 -22.0 VE-d6 437.20 171.20 -21.0 -22.0 -15.0 *表示定量离子对 1.5标准曲线及样品制备 80%甲醇溶液配制 VA/VE 混标工作溶液，浓度依次分别为100/1000 ugmL"、40/400 ugmL、20/200 ugmL、10/100 ugmL-1、4/40 ug*mL-1、2/20 ugmL、1/10 ugmL。80%甲醇溶液配制 VA-d，/VE-d，混标工作溶液，浓度分别为 0.5/20 ugmL。称取 4.0g牛血清白蛋白(BSA)，溶于100mLPBS中，得到 4% BSA 溶液。 分别取 20 uL VA/VE 混标工作溶液溶于 180 pL 4% BSA溶液中，得到 VA/VE 替代基质标准曲线，浓度分别为5/50、2/20、1/10、0.5/5、0.2/2、0.1/1、0.05/0.5 ugmL。 样品前处理方法：超纯水10倍稀释样品 (4% BSA溶液或血清)，取100 uL稀释后样品于2 mL离心管中，加入10 uL 内标工作液及200 uL甲醇， 涡旋混匀后10000 g 离心10 min。加入1 mL正己烷，充分涡旋萃取后，10000g离心10min， 取出900 uL正己烷于2mL 离心管中。氮吹挥干正己烷，加入100 uL 80%甲醇溶液复溶后，直接进样分析。 结果与讨论 2.1标准样品的 MRM色谱图 图3VA标准样品(0.05 ug*mL)MRM色谱图(左)及VA-d，内标(0.5 ugmL-)MRM色谱图(右) 图4VE标准样品(0.5 ugmL-')MRM色谱图(左)及VE-d，内标(20 ug*mL-')MRM色谱图(右) 2.2线性关系 使用4% BSA溶液配制标准曲线，按上述前处理方法和分析条件，采用内标法建立标准曲线。如图5所示，VA、VE分别在0.05-5 ugmL"'和0.5-50 ugmL"'的线性浓度范围内，线性相关性良好，相关系数r分别为 0.9992和0.9995，准确度范围分别为 94.3-104.0%和96.2-103.6%。 图5VA、VE标准曲线 表6 VA、VE标准曲线参数(线性回归，权重系数为Y=1/C) 化合物 校准曲线 线性范围(ugmL-) 准确度(%) 相关系数 r VA ￥=(3.29013)X+(0.00878511) 0.05-5 94.3-104.0 0.9992 VE Y=(0.0436573)X+(0.00257555) 0.5-50 96.2-103.6 0.9995 2.3方法对比 为验证 Nexera MX 平行液相系统对目标物检测分析的高效性，实验另外采用常规超高效液相 LC-30A 对样品进行检测。在相同的洗脱程序下，将常规液质联用系统与 MX 液质联用系统所得色谱图进行对比， MX 液质联用系统检测所需的时间比常规液质联用系统检测缩短约 40%。 图6常规液质联用系统(上)与MX液质联用系统(下)检测VA样品色谱图对比 (x100.000) VE：常规液质联用系统 3.0- 2.0- 1.0- 0.0- 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 min 图77常规液质联用系统(上)与MX液质联用系统(下)检测VE样品色谱图对比 LCMSMS-347 2.4残留 VA-d5残留考察 2.5方法稳定性 1?5(x100.000) 2：VA-d5274.15>218.20(+)CE：-14.0 表7方法稳定性考察结果 项目 VA (ugmL-) VE (ugmL-) 样品1 样品2 样品1 样品2 1 0.38 0.51 46.5 39.1 2 0.39 0.50 47.8 38.6 3 0.38 0.51 46.3 38.2 4 0.38 0.50 46.7 37.3 5 0.38 0.51 47.0 38.4 6 0.38 0.46 47.5 38.7 均值(ugmL-) 0.38 0.50 47.0 38.4 CV(%) 1.5 3.6 1.1 1.5 结论 本文使用岛津 Nexera MX 平行液相色谱质谱和三重四极杆质谱仪 LCMS-8060联用系统，建立了人血清中VA 和VE含量测定方法。该方法在3.5 min 内完成血清中VA、VE含量的检测分析，采用同位素内标法定量，VA、VE在0.05~5.0ugmL和 0.5~50 ugmL浓度范围内线性良好，相关系数分别为 0.9992 和0.9995。通过2例实际血清样品，考察方法稳定性，检测结果 CV% 均小于5.0%，表明方法稳定性良好。 与常规液质联用方法相比， Nexera MX系统充分利用冲统冲洗、色谱柱平衡、自动进样器进样等分析时间，有效提升 LCMS处理速度与分析能力，显著缩短分析时间，提高生物样品检测速率，适用于大样本分析的超高通量检测，可为临床中人血清中VA、VVE 的快速筛查提供良好借鉴和参考。 本文使用岛津Nexera MX平行液相色谱质谱和三重四极杆质谱仪LCMS-8060联用系统，建立了人血清中VA和VE含量测定方法。该方法在3.5 min内完成血清中VA、VE含量的检测分析，采用同位素内标法定量，VA、VE在0.05~5.0 μg∙mL-1和0.5~50 μg∙mL-1浓度范围内线性良好，相关系数分别为0.9992和0.9995。通过2例实际血清样品，考察方法稳定性，检测结果CV%均小于5.0%，表明方法稳定性良好。