人血清中1,5-脱水葡萄糖醇检测方案(液质联用仪)

SSL-CA14-657Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-331 上海市徐汇区宜州路180号华鑫天地二期C801栋 咨询电话：021-34193996http：//www.shimadzu.com.cn Nexeraa MX 平行液相色谱质谱联用系统测定血清中的1，5-脱水葡萄糖醇含量 LCMSMS-331 摘要：本文建立了一种应用岛津 Nexera MX System 超高效平行液相三重四极杆质谱联用系统测定人血清中的1，5-脱水葡萄糖醇含量的检测方法。该方法在“血清中1，5-脱水葡萄糖醇检测试剂盒”的基础上进行的方法开发及验证。样品经该试剂盒处理后，使用岛津Nexera MX System 平行液相三重四极杆质谱联用系统在 2.5 min 内完成分析。1，5-脱水葡萄糖醇在1~50 mg/L 浓度范围内线性良好，相关系数大于0.9999；使用试剂盒内标定浓度为 50 mg/L的标准样品进行了批内和批间的精密度实验，实验结果表明批内和批间的精密度 RSD 分别小于 0.58%和0.64%；同时考察了进样器放置稳定性，结果表明样品在该条件下存放时稳定性良好。此方法快速、简单、选择性强且灵敏度高，可以为临床中人血清中1，5-脱水葡萄糖醇的检测提供很好的借鉴和参考。 关键词： Nexera MX System 平行液相三重四质杆质谱仪1，5-脱水葡萄糖醇 1，5-脱水葡萄糖醇(1，5-anhydroglucitol or 1， 5-AG)是一种天然存在的吡喃环结构的六碳糖，是葡萄糖C-1位置上缺少一个羟基的还原型，它是人体主要多元醇之一，在体内广泛分布于各个器官、组织中。研究显示，1， 5-AG对血糖的变化极其敏感，可以实时反映血糖的变化，因此1，5-AG可以用作为一种短期血糖控制的标志。甚至当出现急性高血糖时，血清中的1，5-AG水平可以反映24h 内血糖调节动力学的变化。此外1，5-AG在血糖正常个体中含量十分稳定，无昼夜差异、不受食物影响，并且与糖尿病病程、体重和年龄等无关。近几年研究表明，定期的1，5-AG测定可以为妊娠期糖尿病预防和治疗提供依据。同时有研究报道，无论是否患有 实验部分 糖尿病，对于存在高风险的心血管疾病的人体，1， 5-AG水平的测定有一定的作用。 本文使用岛津 Nexera MX System 超高效平行液相三重四极杆质谱联用系统，建立人血清中1，5-脱水葡萄糖醇含量测定方法，与常规液质联用方法相比，Nexera MX 系统在保证方法精密度与稳定性的基础上，充分利用系统冲洗、色谱柱平衡、自动进样器进样等分析时间，提供较以往两倍的 LCMS 处理速度与分析能力，显著缩短分析时间，提高生物样品检测速率，实现LCMS数据采集速度最大化，适用于大样本分析的超高通量检测。 1.1化合物信息 表1化合物信息 化合物名称 CAS No. 分子式 分子量 结构式 CH2OH 1，5-脱水葡萄糖醇 154-58-5 C6H12O5 164.16 HO (1.5-AG) HO OH I3C6-1，5-脱水葡萄 13CH2OH 13C—C 13C6H12O5 170.16 HO-13(3c 13c 13c-13c 糖醇(I3C6-1，5-AG) HO OH 1.2仪器 本实验使用岛津 Nexera MX 超高效平行液相与三重四极杆质谱仪LCMS-8050 联用系统。具体配置为 LC-30ADx4输液泵， DGU-20A5R、DGU-20A3R 在线脱气机， SIL-30ACMP 自动进样器， CTO-20AC 柱温箱， CBM-20A 系统控制器， LCMS-8050三重四极杆质谱仪， LabSolutions Ver. 5.89 色谱工作站。 1.3仪器结构及原理 1.4分析条件 液相条件 色谱柱： Shim-pack GISS-HP C18(2.1 mm I.D. 进样量： 2pL ×100 mm L.， 3.0 um) 流动相：A相-水，B相-乙腈流速：0.2mL/min柱温：40℃ 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为10%，洗脱程序见表2、表3。(表4为常规液相梯度洗脱程序，B相初始浓度为10%，两系统液相梯度曲线图见图1、图2。) Time(min) Module Command Value 0.20 Pumps Pump B Conc. 10 2.00 Pumps Pump B Conc. 80 2.50 Controller Stop 表3冲洗平衡流路梯度洗脱程序 Time(min) Module Command Value 0.00 Pumps Pump B Conc. 10 2.50 Controller Stop 表4岸常规液相梯度洗脱程序 Time(min) Module Command Value 0.20 Pumps Pump B Conc. 10 2.00 Pumps Pump B Conc. 80 2.50 Pumps Pump B Conc. 80 2.51 Pumps Pump B Conc. 10 5.00 Controller Stop 图1MX系统液相梯度曲线图 图2常规液相梯度曲线图 质谱条件 分析仪器： LCMS-8050 接口温度：300℃ 离子化模式： ESI(-) DL 温度：250℃ 离子源接口电压：-4.0kV 加热模块温度：450℃ 雾化气：氮气3.0 L/min 扫描模式：多反应监测(MRM) 加热气：空气10.0L/min 驻留时间：200ms 干燥气：氮气10.0L/min 延迟时间：3ms 碰撞气：氩气 MRM参数：见表5 表5 MRM优化参数 化合物 前体离子 产物离子 Q1Pre Bias (V) CE (V) Q3 Pre Bias (V) 1.5-AG 163.00 101.00 28.0 12.0 16.0 13C6-1，5-AG 169.00 105.00 28.0 12.0 16.0 1.5标准样品、质控品及样品制备 使用1，5-脱水葡萄糖醇检测试剂盒(液相色谱-串联质谱法，上海复星长征公司)。该试剂盒包含以下部分：标准物质：3个水平的标准样品(1.5 mL， 浓度分别为1 mg/L、10 mg/L、50 mg/L) 质控品：1个水平的质控品(1.5mL， 浓度为 15 mg/L) 沉淀剂(含内标)：C，-1，5-脱水葡萄糖醇(4.8mL，浓度为20 mg/L) 标准样品、质控品前处理方法：取50uL标准样品或质控品于1.5 mL离心管中，分别加入20 uL沉淀剂、180uL乙腈，混匀，涡旋混合30s，高速离心(20000 rpm)3 min， 吸取 50 pL上清液，加入50uL水，混匀后供色谱进样分析。(经前处理后对照品进样浓度相当于 0.1 mg/L、1 mg/L、5 mg/L；质控品浓度相当于 1.5 mg/L) 样品前处理方法：取50uL血清样品于 1.5 mL离心管中，分别加入20 pL 沉淀剂、180pL乙腈，混匀，涡旋混合30 s， 高速离心(20000 rpm)3 min， 吸取 50 pL上清液，加入50uL水，混匀后供色谱进样分析。 结果与讨论 2.1标准样品的 MRM色谱图 图3标准样品MRM色谱图(浓度为10 mg/L) 图4 内标MRM色谱图(浓度为20 mg/L) 2.2质控品的 MRM 色谱图 图5质控品MRM色谱图(浓度为15 mg/L) 图6内标MRM色谱图(浓度为20 mg/L) 2.3样品的 MRM 色谱图 图7样品MRM色谱图(浓度为26.18 mg/L) 图8内标MRM色谱图(浓度为20 mg/L) 2.4专属性考察 按照1.5中的样品前处理方法制备 double blank 和 blank，按照1.4中条件进行分析后得到的色谱图，如图9、图10所示，色谱图显示，本方法专属性强。 图9 double blank 谱图 图10 blank谱图(浓度为20 mg/L) 2.5线性关系 连续三天对试剂盒内三个浓度的标准样品，按1.4中的分析条件进行了3个批次的分析，以浓度为横坐标，峰面积比值为纵坐标，内标法制作制作曲线。在 1~50 mg/L 进样浓度范围内线性良好。线性方程、线性范围和相关系数见表6。 表6校准曲线参数 编号 校准曲线 线性范围(mg/L) 准确度(%) 相关系数r 批1 Y=(0.109583)X+(-0.00488135) 1~50 97.2~101.6% 0.9999 批2 Y=(0.108947)X+(0.00228196) 1~50 99.6~100.4% 0.9999 批3 Y=(0.109597)X+(-0.00571962) 1~50 99.6~103.5% 0.9999 图10批1校准曲线 图11批2校准曲线 图12批3校准曲线 2.6检出限和定量限 对浓度为1 mg/L 的标准样品按照1.5的方法进行前处理后进样分析(进样浓度0.1 mg/L)， 最低检出限 (S/N=3，LOD 表示)、最低定量限 (S/N=10，LOQ表示)结果如表7所示。 表7检出限和定量限 名称 信噪比 检出限(mg/L) 定量限(mg/L) 1，5-AG 276.5 0.001 0.004 2.7质控品准确度考察 按1.4中的分析条件和1.5中的前处理方法对试剂盒中的质控品进行分析，质控品的准确度结果如下表所示，结果显示，测定结果与靶值接近，完全落在质控样本的靶值范围之内(靶值由试剂盒提供)。 表8月质控样本测试结果 编号 靶值(mg/L) 靶值范围(mg/L) 测定浓度(mg/L) 准确度% QC-1 15 13.5~16.5 14.519 96.8 QC-2 14.471 96.5 QC-3 14.582 97.2 QC-4 14.474 96.5 QC-5 14.511 96.7 QC-6 14.335 95.6 RSD 0.57% 2.8批内、批间精密度实验 连续三天对试剂盒中浓度为 50 mg/L 的标准样品测定6次，进行三个批次分析，考察批内、批间的精密度，结果如表9所示。1，5-AG批内和批间精密度分别小于0.58%和0.64%。 表9批内批间精密度结果(mg/L) 理论值 批内精密度(n=6) 批间精密度(n=18) 平均实测值 RSD 平均实测值 RSD 50 50.006 0.58% 50.003 0.64% 2.9稳定性实验 取3批次血清样品，按1.5中的前处理方法处理样品后，进行进样器放置0天、1天及2天稳定性考察，结果如下表所示，表中结果显示，该方法稳定性良好。 表10进样器放置稳定性考察结果 样品 0天实测浓度(umol/L) 放置时间(天) 浓度比例百分比(%) 0 100.0 样品1 26.18 1 99.6 2 99.3 0 100.0 样品2 27.98 1 99.9 2 100.2 0 100.0 样品3 32.90 1 100.5 2 99.7 结论 本文使用岛津 Nexera MX System 超高效平行液相三重四极杆质谱联用系统，建立人血清中1，5-脱水葡萄糖醇含量测定方法，与常规液质联用方法相比， Nexera MX 系统在保证方法精密度与稳定性的基础上，充分利用系统冲洗、色谱柱平衡、自动进样器进样等分析时间，提供较以往两倍的 LCMS 处理速度与分析能力，显著缩短分析时间，提高生物样品检测速率，实现 LCMS 数据采集速度最大化，适用于大样本分析的超高通量检测，可以为临床中人血清中1，5-脱水葡萄糖醇的检测提供很好的借鉴和参考。 田岛津全球应用技术开发支持中心 本文建立了一种应用岛津Nexera MX System超高效平行液相三重四极杆质谱联用系统测定人血清中的l,5-脱水葡萄糖醇含量的检测方法。该方法在“血清中l,5-脱水葡萄糖醇检测试剂盒”的基础上进行的方法开发及验证。样品经该试剂盒处理后，使用岛津Nexera MX System平行液相三重四极杆质谱联用系统在2.5 min内完成分析。l,5-脱水葡萄糖醇在1~50 mg /L浓度范围内线性良好，相关系数大于0.9999；使用试剂盒内标定浓度为50 mg/L的标准样品进行了批内和批间的精密度实验，实验结果表明批内和批间的精密度RSD分别小于0.58%和0.64%；同时考察了进样器放置稳定性，结果表明样品在该条件下存放时稳定性良好。此方法快速、简单、选择性强且灵敏度高，可以为临床中人血清中l,5-脱水葡萄糖醇的检测提供很好的借鉴和参考。