大鼠血浆中布洛芬检测方案(液质联用仪)

SSL-CA14-597Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-321 上海市徐汇区宜州路180号华鑫天地二期C801栋 咨询电话：021-34193996http：//www.shimadzu.com.cn 超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用技术测定大鼠血浆中布洛芬含量 LCMSMS-321 摘要：本文建立与验证了使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8060 联用测定大鼠血浆中布洛芬的方法。方法采用同位素内标法布洛芬-D3定量，定量限20 ng/mL， 线性范围为20-15000 ng/mL， 相关系数0.9986。方法选择性考察结果表明大鼠空白血浆中无明显干扰，定量下限日内、日间精密度均小于6%。低中高三水平质控浓度日内精密度 0.95-2.07%，日间精密度 2.19-3.50%，各浓度水平质控样品的准确度91.8-112.1%，能够满足大鼠血浆中药物浓度准确定量的要求。低中高三质控样品布洛芬回收率均大于90%，基质效应大于92%。稳定性考察结果显示样品在室温下放置12小时稳定，3次冻融循环布洛芬浓度无显著变化，大鼠血浆样品提取液待测环境下放置96h稳定。该方法具有分析速度快、灵敏度高、重复性好的特点，适合大鼠血浆中布洛芬含量的快速准确检测，可用于人体内布洛芬浓度的测定及其人体药代动力学研究，为指导临床布洛芬浓度检测提供帮助。 关键词：超高效液相色谱三重四极杆质谱大鼠血浆布洛芬 布洛芬属苯丙酸非甾体类抗炎消炎药，具有抗炎、镇痛、解热等作用，临床常用于缓解轻至中度疼痛以及普通感冒或流行性感冒引起的发热，是世界卫生组织、美国 FDA 唯一共同推荐的儿童退烧药。然而，临床研究发现，该药物半衰期较短，长期服用该药物会造成肾功能衰竭。因此，为使药物使用更为安全合理，顺应临 实验部分 床个体化的用药趋势，需对布洛芬药物建立一种高效、灵敏的检测方法，监测血药浓度，了解药物体内变化，减少临床用药不良反应的发生。 本实验使用 LCMS-8060 建立更为灵敏、高效的大鼠血浆中布洛芬含量的检测方法，供相关人员参考。 1.1化合物信息 表1化合物信息 化合物名称 英文名 CAS No. 分子式 结构式 OH 布洛芬 Ibuprofen 15687-27-1 C13H18O2 D、 OH 布洛芬-D3 Ibuprofen-d3 121662-14-4 C13H15D302 (IS) 1.2仪器 本实验使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 与三重四极杆质谱仪 LCMS-8060 联用系统。具体配置为 LC-30ADx2输液泵， DGU-20A5R 在线脱气机， SIL-30ACMP 自动进样器， CTO-20AC柱温箱， CBM-20A系统控制器， LCMS-8060 三重四极杆质谱仪， LabSolutions Ver. 5.89 色谱工作站。 1.3分析条件 液相条件 色谱柱： Shim-pack GIST C18(2.1 mm I.D.×100 mm L.，2.0 um) 柱温：40℃ 进样量：5uL 流动相：A相-2mM醋酸铵，0.05%氨水溶液；B相-乙腈 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为20%，洗脱程序见表2。 流速：0.4 mL/min 表2梯度洗脱程序 Time(min) Module Command Value 0.50 Pumps Pump B Conc. 20 4.00 Pumps Pump B Conc. 95 4.50 Pumps Pump B Conc. 95 4.60 Pumps Pump B Conc. 20 6.50 Controller Stop 质谱条件 分析仪器： LCMS-8060 接口温度：300℃ 离子化模式： ESI(-) DL温度：250℃ 离子源接口电压：-4.0kV 加热模块温度：400℃ 雾化气：氮气3.0L/min 扫描模式：多反应监测(MRM) 加热气：空气10.0 L/min 驻留时间：147 ms 干燥气：氮气10.0 L/min 延迟时间：3ms 碰撞气：氩气 MRM参数：见表3 表3 MRM优化参数 化合物 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias (V) CE(V) Q3 Pre Bias (V) 布洛芬 205.15 161.20 14.0 9.0 12.0 布洛芬-D3 208.15 164.20 14.0 8.0 19.0 1.4标准品与质控样品的配制 分别精密称取两份布洛芬适量，量纯甲醇溶解配制两份1.0 mg/mL布洛芬储备液。取其中一份储备液用50%甲醇溶液逐级稀释成浓度为1.0、2.5、7.5、25、75、250、750 ug/mL的标准工作曲线；另一份储备液用50%甲醇溶液分别稀释成浓度为3、30、600 ug/mL 的质控溶液。分别取标准工作曲线中各浓度点20 uL 加入980 pL 大鼠空白血浆中，依次配制成标准曲线20、50、150、500、1500、5000、15000 ng/mL；分别取三个不同浓度质控溶液 20 pL 加入980pL大鼠空白血浆中，依次配制成60、600、12000 ng/mL 质控样品。 精密称取布洛芬-D3适量，用纯甲醇溶液溶解配制为1.0 mg/mL 储备液。将配制好的布洛芬-D3储备液用50%甲醇溶液稀释为 5500 ng/mL 内标溶液，待用。 1.5大鼠血浆样品前处理方法 取大鼠血浆样品100 pL， 依次加入5500 ng/mL 内标溶液10 pL、甲醇400pL， 涡旋混合3 min， 13000 rpm/min离心10 min， 吸取上清液进样分析，进样体积5uL。 结果与讨论 2.1标准样品一级质谱图与产物离子扫描质谱图 布洛芬在一级质谱扫描下主要生成[M-H]准分子离子峰m/z 205.15，对准分子离子峰进行产物离子扫描，生成主要碎片离子为 m/z 161.20；布洛芬-D3在一级质谱扫描下主要生成[M-H]准分子离子峰 m/z 208.15， 对准分子离子峰进行产物离子扫描，生成主要碎片离子为 m/z 164.20， 其一级质谱图与产物离子扫描图分别见图1-4。 Inten(x10.000.000) 图1布洛芬一级质谱图 图2布洛芬产物离子扫描图(CE值-13V) Inte n(x10，000，000) 图33布洛芬-D3一级质谱图 图47布洛芬-D3产物离子扫描图(CE值-12V) 2.2方法选择性 取大鼠空白血浆，按照1.5方法和选定的色谱条件处理并测定，得大鼠空白血浆、20 ng/mL 大鼠血浆基质加标样品的 MRM 色谱图，见图5。结果表明，布洛芬与内标物的保留时间 t均为 2.03 min。大鼠空白血浆中的内源物质干扰，对样品检测无明显影响，方法具有较强选择性。 图5布洛芬与布洛芬-D3MRM色谱图(A、B：大鼠空白血浆； C： 20 ng/mL布洛芬大鼠血浆样品； D：5500ng/mL布洛芬-D3大鼠血浆基质加标) 2.3线性范围 按照1.4项下大鼠血浆样品配制方法制备20、50、150、500、1500、5000、15000 ng/mL 大鼠血浆标准工作曲线，按照1.5项中大鼠血浆样品前处理方法处理大鼠血浆样品，建立标准曲线，并用同位素内标法进行分析测定。以大鼠血浆中布洛芬浓度与内标浓度(以1计)的比值X为横坐标，以布洛芬峰面积与布洛芬-D3峰面积的比值Y为纵坐标，权重系数为1/C，进行线性回归分析，所得标准曲线见图6，大鼠血浆中布洛芬线性回归方程及相关系数见表4。结果表明布洛芬在20-15000 ng/mL的浓度范围内线性关系良好。 图6布洛芬标准曲线 表4布洛芬标准曲线参数(线性回归，权重系数为Y=1/C²) 化合物 校准曲线 线性范围 (ng/mL) 准确度(%) 相关系数r 布洛芬 Y=(0.00178586)X+(0.0155891) 20-15000 94.3~108.6 0.9986 表5标准曲线各浓度点准确度 级别 标准浓度(ng/mL) 实测浓度 (ng/mL) 准确度(%) 1 20 20.486 102.4 2 50 47.133 94.3 3 150 150.499 100.3 4 500 476.979 95.4 5 1500 1，493.372 99.6 6 5000 4，968.698 99.4 7 15000 16，296.362 108.6 2.4方法精密度与准确度 取已配制好的60、600、12000 ng/mL 质控样品以及定量下限 20 ng/mL样品，按照1.5方法制备，每个浓度的大血浆样品在1天内制备6份平行样品分析，连续测定3天，每日随行标准曲线，用测得质控样品中布洛芬峰面积的RSD%值计算其日间和日内差异，结果见表6。其中布洛芬最低定量限 S/N 平均值为37。结果表明，各浓度水平精密度、准确度以及该方法的灵敏度均在接受标准内，并已满足临床检测浓度要求。 表6布洛芬日内精密度与日间将密度(3天，每天n=6) 样品类型 理论浓度 (ng/mL) 日内精密度 日间精密度 准确度% RSD% RSD% LLOQ 20 4.91 5.97 90.2-111.5 LOQ 60 2.07 3.50 91.8-103.2 MOQ 600 1.32 3.13 93.3-104.9 HOQ 12000 0.95 2.19 104.6-112.1 2.5回收率 取浓度为60、600、12000 ng/mL 质控样品(每个浓度重复6次)，按照1.5方法制备，以大鼠血浆样本制备进样检测后色谱峰面积(A1)与大鼠空白血浆按照1.5方法处理后加入标准品溶液进样检测所得色谱峰面积(A2)之比，即A1/A2x100%，考察大鼠血浆样本处理方法的提取回收率。实验结果见表7，各浓度水平布洛芬回收率均大于90%、RSD 小于 5%。 表7布洛芬日内精密度与日间将密度(n=6) 浓度水平 理论浓度 (ng/mL) 平均回收率% RSD% LQC 0.15 95.1 4.14 MQC 5 90.8 4.40 HQC 80 94.0 0.95 2.6基质效应 考察低、中、高三浓度水平质控沐品(每个浓度重复6次)，通过比较大鼠空白血浆后加标样品与浓度一致的标准溶液，两者的目标化合物面积平均值所得比值即为基质效应。结果见表8，各浓度水平基质效应因子均大于92%。 浓度水平 理论浓度 (ng/mL) 基质效应% A/Ais 基质效应 LQC 60 92.7 99.5 MQC 600 98.1 105.3 HQC 12000 96.2 103.3 内标基质效应 - 93.1 一 2.7稳定性试验 为评价生物样品在周围环境(如室温、光照)下的稳定性，将低、中、高三浓度水平质控样品(n=6)在室温桌面放置12h以上，按照1.5方法制备并进行测定，将测定值浓度与理论值进行比较。结果显示，三个浓度水平的质控样品测定值与理论值的差异均在±9%以内。大鼠血浆中布洛芬在室温下放置12h以上具有良好稳定性。 考察生物样品在处理、制备等过程中反复冻融的稳定性，将高、中、低质控样品(n=6)反复冻融三个周期，每一周期大于12h，经制备后同法测定，与理论值进行比较。结果显示，测定值与理论值的差异均在±8%以内。说明大鼠血浆中布洛芬的浓度在3次冻融循环的过程中不会发生显著的改变。 考察生物样品经制备后，在待测环境中的稳定性，将低、中、高三浓度水平质控样品(n=6)在待测环境下放置96 h，将测定值与理论值进行比较。结果显示，测定值与理论值的差异均在±8%以内。说明大鼠血浆中布洛芬的浓度在待测环境中放置后，其含量可保持稳定。 2.8系统残留考察 (Carryover) 考察系统残留的影响，完成浓度最高点分析后，其后分析空白样品中布洛芬的峰面积，空白样品中布洛芬及其内标物的通道中均没有明显的目标化合物色谱峰。 结论 本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8060 联用测定大鼠血浆中布洛芬的方法。该方法在6.5 min 内完成大鼠血浆中布洛芬的检测，采用同位素内标法定量，方法定量限20 ng/mL， 线性范围20-15000 ng/mL， 相关系数在0.9986。选择性考察结果表明大鼠空白血浆中没有对分析造成明显干扰的物质。方法中定量下限日内、日间精密度 4.91%与5.97%， S/N 平均值为37。低中高三水平质控浓度日内精密度 0.95-2.07%，日间精密度2.19-3.50%，各浓度水平质控样品的准确度91.8-112.1%，能够满足大鼠血浆中药物浓度准确定量的要求；各浓度水平布洛芬回收率均大于90%， RSD 小于5%，基质效应大于92%；稳定性实验结果显示样品在室温下放置12小时稳定，3次冻融循环布洛芬浓度无显著变化，大鼠血浆样品提取液待测环境下放置96 h稳定。方法具有分析方法简单、分析速度快、灵敏度高、重现性好的特点，满足布洛芬体内药物分析要求，适合大鼠血浆中布洛芬含量的快速准确检测。 ( 岛津全球应用技术开发支持中心 ) 该解决方案建立与验证了使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A和三重四极杆质谱仪LCMS-8060联用测定大鼠血浆中布洛芬的方法。方法采用同位素内标法布洛芬-D3定量，定量限20 ng/mL，线性范围为20-15000 ng/mL，相关系数0.9986。方法选择性考察结果表明大鼠空白血浆中无明显干扰，定量下限日内、日间精密度均小于6%。低中高三水平质控浓度日内精密度0.95-2.07%，日间精密度2.19-3.50%，各浓度水平质控样品的准确度91.8-112.1%，能够满足大鼠血浆中药物浓度准确定量的要求。低中高三质控样品布洛芬回收率均大于90%，基质效应大于92%。稳定性考察结果显示样品在室温下放置12小时稳定，3次冻融循环布洛芬浓度无显著变化，大鼠血浆样品提取液待测环境下放置96 h稳定。该方法具有分析速度快、灵敏度高、重复性好的特点，满足布洛芬体内药物分析要求，适合大鼠血浆中布洛芬含量的快速准确检测。