基因组 DNA中分子量检测方案(生物芯片)

Agilent 4200 TapeStationAgilent 2100生物分析仪 Agilent SureSelectXTWGS文库制备的质量控制 应用简报 作者 摘要 Eva Graf 安捷伦科技有限公司 Waldbronn， Germany 本应用简报按照 Agilent SureSelectXT WGS 文库制备方案，介绍了 Agilent4200 TapeStation 系统在工作流程中的样品质量控制 (QC) 性能。基因组DNA ScreenTape分析法是对基因组 DNA 起始材料进行系列定量分析并提供完整性信息的可靠方法。安捷伦高灵敏度 D5000 ScreenTape 分析法可在测序前对扩增的标签文库进行分子量测定和定量分析。数据还表明， 采用DNA ScreenTape 分析法所获得的结果与使用 Agilent 2100 生物分析仪系统和 Qubit 荧光计进行分析所得到的信息相一致。 Agilent Technologies 前言 Agilent SureSelectxl 全基因组文库制备试剂盒可生成用于 Illumina 配对末端多重测序的文库。SureSelectQXT文库制备对基因组 DNA (gDNA) 的起始量变化非常敏感。本方案建议使用Qubit 仪器进行两次系列荧光分析来定量。采用基因组 DNA ScreenTape分析法在 Agilent 4200 TapeStation系统上运行相同样品，比较这两种方法所获得的结果。gDNA 起始量的偏差会导致所得片段分布不理想，使扩增文库中过大或过小的 DNA 片段所占比例过高。这种效应可以通过由各种 gDNA起始材料(从低丰度到高丰度)产生的额外文库来说明。 扩增文库使用安捷伦高灵敏度 D5000ScreenTape 分析法及4200 TapeStation 系统进行分析，将其结果与 SureSelectQXT方案推荐的高灵敏度 DNA 分析法及 Agilent 2100生物分析仪系统分析所得结果进行比较。 扩增文库的分析结果显示，高灵敏度D5000 ScreenTape 分析与2100生物分析仪系统获得的分子量和摩尔浓度结果相一致。 材料与方法 4200 TapeStation 系统 (G2991AA)、2100 生物分析仪系统(G2939AA)、SureCycler 8800 热循环仪 (G8800A)、用于 WGS 的 SureSelectXT文库制备试剂盒 (G9682A)、高灵敏度 D5000ScreenTape (5067-5592)和试剂(5067-5593)、基因组 DNA ScreenTape(5067-5365) 和试剂(5067-5366)、高灵敏度 DNA 试剂盒(5067-4626)，以及OneSeq 参比 DNA 男性(5190-8848)购自安捷伦科技公司。NanoDrop1000、Qubit 3.0 荧光计 (Q33216) 和Qubit dsDNA BR 分析试剂盒 (Q32850)购自赛默飞世尔科技公司。使用区域功能来实现 DNA 文库的定量测定。除非另有说明，否则所有分析均按照生产商的方案和指南进行。 图 1. Agilent SureSelectXT WGS 文库制备工作流程及质量控制步骤 结果与讨论 图1说明了使用 gDNA 作为起始材料生成全基因组测序(WGS)文库的SureSelectX方案。简而言之，样品在一步酶解步骤中进行碎裂和接头标记，然后进行 PCR扩增，在此期间对接头连接的片段进行扩增和标记。然后使用磁珠清洁扩增的接头连接的文库，并在测序前分析以确定合适的分子量、数量，并进行纯度(不含接头二聚体产物)评估。 gDNA 的数量和完整性 SureSelectXT WGS 方案需要高质量的DNA 样品，以获得最佳性能和 gDNA起始材料的精确定量结果。按照该方案使用配有 dsDNA BR分析试剂盒的Qubit 仪器进行系列定量分析。将相同的样品在4200 TapeStation系统和NanoDrop 中均进行6次重复基因组DNA ScreenTape分析。图2显示了获自4200 TapeStation 系统、Qubit和 NanoDrop 的数据，说明了基因组 DNA ScreenTape 分析法适用于对qDNA 起始材料进行定量分析。采用UV 光谱法测定 gDNA 所得的量常会过高，这是由于其他缓冲液成分在 UV光谱中也可能有吸收。 此外，基因组 DNA ScreenTape 分析法可在同一QC 步骤中客观评价样品完整性。样品完整性由 TapeStation分析软件的 DNA 完整值(DIN)计算功能自动测定(图3)。 [bp] A1 B1 C1 DIN DIN DIN 9.2 7.9 8.3 图3.采用安捷伦基因组 DNA ScreenTape 分析法分析基因组 DNA 起始样品所得的胶图。该胶图显示样品完整性良好，其由凝胶线下方的DNA 完整值(DIN)表明 与其他系统不同的是，基因组DNAScreenTape 分析方法及4200TapeStation 系统只需 1 pL 样品即可在一步分析中同时对质量和数量进行评价。 Agilent SureSelectXT 全基因组文库的片段分子量测定 除了 gDNA 起始材料的初始质量控制外， SureSelectXT方案还建议对扩增文库进行质量控制，从而确保在测序前显示整个片段的分子量范围。片段 平均分子量显著小于 600 bp 可能表明碎裂反应中的 gDNA 过少，或者可能与测序数据的重复分析次数增加有关。相反，文库中片段平均分子量异常大(超过1000 bp) 可能表明碎裂反应中的 gDNA 过多，并且可能需要更高的 DNA 浓度以在测序反应中获得最佳的群集密度。 为了证明这一点，制备起始量为 20、50和80 ng 的文库，用 50 ng gDNA样品生成的文库作为标准文库。图4显示了与2100生物分析仪系统相比， 图2.安捷伦基因组 DNA ScreenTape 分析法所得的定量分析数据与由Qubit 和 NanoDrop 所得数据比较 图 4. Agilent 4200 TapeStation 与 Agilent 2100 生物分析仪所得片段分子量比较。针对起始量分别为20、50(推荐)和80 ng gDNA的文库，对其平均分子量进行了比较。虚线显示了可接受的扩增文库的平均分子量范围(600 bp 和1000 bp) 4200 TapeStation 系统在评估分子量测定方面的性能，通过用上述起始量对文库进行三次重复区域分析来评估。图中的数据展现了两个系统所得的文库分子量有很好的相关性。 不同gDNA起始量的电泳叠加图显示，使用2100生物分析仪(A)和4200 TapeStation(B)系统，文库片段分子量分布(图5)呈现出不同的弥散条带曲线。50 ng 的最佳 gDNA起始量可得到平均分子量在600-1000bp之间的文库曲线。最小的 gDNA起始量产生的文库通常会导致其分子量范围趋向于更小。相反， gDNA 起始量过大会导致大 DNA 片段比例过高，从而产生的文库的分子量范围趋向于更大。此外，所有电泳图均未显示接头二聚体产物，表明文库纯度很高。 SureSelectXT 全基因组文库的定量分析 对于多重测序，将 SureSelectQXT全基因组文库合并，使每个插入标记的样品在库中的摩尔量相同。文库的最佳起始浓度取决于测序平台。它可能还需要根据文库的 DNA 片段分子量范围进行优化，以获得所需的最终量和数据质量。4200 TapeStation 和2100生物分析仪系统可在区域表中提供摩尔浓度定量数据和分子量信息(图6)。 图5.使用 Agilent 4200 TapeStation (A) 和 Agilent 2100生物分析仪乡统(B)， gDNA 起始量分别为20(蓝色)、50(推荐，红色)和80ng(绿色)所得文库的电泳叠加图 图6.显示扩增文库的平均分子量、浓度和摩尔浓农的区域表屏幕截图。A)区域视图中的 Agilent TapeStation分析软件。 B) Agilent 2100 Expert 软件中的弥散条带分析结果 对于每个由不同gDNA 起始量产生的文库，将其摩尔浓度绘制在两个系统的对比图中(图7)。 表1中的汇总数据表明，使用高灵敏度 D5000 ScreenTape 分析法得到的扩增文库的分子量和定量分析结果， 与SureSelectXT WGS 方案推荐的2100生物分析仪系统及高灵敏度 DNA分析法得到的结果相一致。 结论 本应用简报证明了 Agilent 4200 TapeStation 是可用于 AgilentSureSelect&XT WGS 文库制备过程中进行样品分析的可靠系统。 高质量 DNA 样品和 gDNA 起始材料高重现性的定量结果是成功制备SureSelectQXT 文库必不可少的条件。 安捷伦基因组 DNA ScreenTape 分析法可对基因组 DNA起始材料实现精确定量分析，并在同一QC步骤中对样品完整性进行评估。 ( 安捷伦高灵敏度 D5000 ScreenTape 分析法是用于SureSelectQXT WGS 扩 增文库的分子量测定和定量分析的理想工具。4200 TapeStation 系统除 了具有与 SureSelectQXT方案推荐的 Agilent 2100 生物分析仪系统等效的性能外，还具有高度灵活的样品通量 和易用性。 ) 图7. Agilent 4200 TapeStation 和 Agilent 2100生物分析仪系统所得的扩增文库的定量分析结果比较 表 1.使用 Agilent 4200 TapeStation 和 Agilent 2100 生物分析仪系统分析扩增文库所得的分子量和定量分析结果 平均分子量(bp) 区域摩尔浓度 (pmol/L) Agilent 4200 Agilent 2100 Agilent 4200 Agilent 2100 起始材料 TapeStation 系统 ： 生物分析仪系统 TapeStation 系统 生物分析仪系统 20 ng 均值 519 533 850 817 %CV 1.2 2.8 5.4 0.6 50 ng 均值 849 868 1513 1473 %CV 0.6 1.4 1.7 4.5 80ng 均值 1065 1157 2073 2097 %CV 3.8 1.1 4.3 5.5 ( 参考文献 ) 1. G9682-90000. SureSelectQXT Whole Genome Library Prep for Illumina Multiplexed Sequencing (用于 Illumina 多重测序的 SureSelectQXT 全基因组文库制备 试剂盒) http：//www.agilent.com/ cs/library/usermanuals/Public/ G9682-90000.pdf 2. G2991-90150. Agilent High Sensitivity D5000 ScreenTape Assay Quick Guide for 4200 TapeStation System (用于4200 TapeStation 系统的安捷伦高灵 敏度 D5000 ScreenTape 分析快 速指南)。 http：//www.agilent. com/cs/library/usermanuals/ Public/4200-TapeStation_HS- D5000_QG.pdf 3. G2991-90040. Agilent Genomic DNA ScreenTape Assay Quick Guide for 4200 TapeStation System (用于4200 TapeStation 系统的安捷伦基基组 DNAScreenTape分析快速指南)。http：//www.agilent.com/cs/library/usermanuals/ Public/4200-TapeStation_gDNA_ QG.pdf 4. O'Neill， M.； et al. Comparison of the TLDA with the Nanodrop andthe reference Qubit system. J.Physics： Conference Series 2011，Volume 307， Issue 1.http：//www.iopscience.iop.org/1742-6596/307/1/012047 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 仅限研究使用。 不可用于诊断目的。 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 c 安捷伦科技(中国)有限公司， 2017 2017年7月1日，中国出版 5991-8191ZHCN 摘要本应用简报按照 Agilent SureSelectQXT WGS 文库制备方案，介绍了 Agilent 4200 TapeStation 系统在工作流程中的样品质量控制 (QC) 性能。基因组 DNA ScreenTape 分析法是对基因组 DNA 起始材料进行系列定量分析并提供完整性信息的可靠方法。安捷伦高灵敏度 D5000 ScreenTape 分析法可在测序前对扩增的标签文库进行分子量测定和定量分析。数据还表明，采用 DNA ScreenTape 分析法所获得的结果与使用 Agilent 2100 生物分析仪系统和 Qubit 荧光计进行分析所得到的信息相一致。前言Agilent SureSelectQXT 全基因组文库制备试剂盒可生成用于 Illumina 配对末端多重测序的文库。SureSelectQXT 文库制备对基因组 DNA (gDNA) 的起始量变化非常敏感。本方案建议使用 Qubit 仪器进行两次系列荧光分析来定量。采用基因组 DNA ScreenTape 分析法在 Agilent 4200 TapeStation 系统上运行相同样品，比较这两种方法所获得的结果。gDNA 起始量的偏差会导致所得片段分布不理想，使扩增文库中过大或过小的 DNA 片段所占比例过高。这种效应可以通过由各种 gDNA 起始材料（从低丰度到高丰度）产生的额外文库来说明。扩增文库使用安捷伦高灵敏度 D5000 ScreenTape 分析法及 4200 TapeStation 系统进行分析，将其结果与 SureSelectQXT 方案推荐的高灵敏度 DNA 分析法及 Agilent 2100 生物分析仪系统分析所得结果进行比较。扩增文库的分析结果显示，高灵敏度 D5000 ScreenTape 分析与 2100 生物分析仪系统获得的分子量和摩尔浓度结果相一致。结论本应用简报证明了 Agilent 4200 TapeStation 是可用于 Agilent SureSelectQXT WGS 文库制备过程中进行样品分析的可靠系统。高质量 DNA 样品和 gDNA 起始材料高重现性的定量结果是成功制备 SureSelectQXT 文库必不可少的条件。安捷伦基因组 DNA ScreenTape 分析法可对基因组 DNA 起始材料实现精确定量分析，并在同一 QC 步骤中对样品完整性进行评估。安捷伦高灵敏度 D5000 ScreenTape 分析法是用于 SureSelectQXT WGS 扩增文库的分子量测定和定量分析的理想工具。4200 TapeStation 系统除了具有与 SureSelectQXT 方案推荐的Agilent 2100 生物分析仪系统等效的性能外，还具有高度灵活的样品通量和易用性。