禽饲料中水溶性着色剂检测方案(液相色谱仪)

应用简报 Agilent食品检测与农业Trusted Answers 采用固相萃取-高效液相色谱法测定禽饲料中的水溶性着色剂 刘明艳 北京市海淀区产品质量监督检验所 吴华、吴翠玲、黄悯嘉 安捷伦科技(中国)有限公司 本文采用乙腈-氨水溶液提取、Agilent Bond Elut PSA 固相萃取小柱富集和净化、AgilentPoroshell 120 EC-C18 色谱柱快速分离，建立了同时检测禽饲料中7种禁用水溶性着色剂的液相色谱分析方法。该方法在 0.5-20 pg/mL 浓度范围内线性相关性良好，相关系数R'≥0.998。对于鸡浓缩饲料和鸡配合饲料，加标浓度为2.0、10.0、20.0 mg/kg 的7种着色剂的平均回收率均处于 68.3%-119.2%的范围内，相对标准偏差为 0.7%-10.0%(n=3)。7种着色剂的方法检测限≤ 0.09 mg/kg， 在15min 内即可完成快速分离与高灵敏度分析。 合成着色剂通常由苯、甲苯、萘等化工原料经过一系列有机反应获得，以价格低廉、染色性能好且用量少等优点而得到广泛应用。近年来，在饲料中添加合成着色剂以改善畜产品肉质颜色的现象经常出现，可能危及消费者的健康和安全。为加强对饲料安全的监管，农业部第1126号公告明确规定了禽饲料中允许和禁止添加的合成着色剂名单，但尚未发布配套的标准检测方法。 针对相关关类饲料中禁用合成着色剂的检测需求，本文采用 Agilent 1260 液相色谱系统和Agilent Bond Elut PSA 固相萃取小柱，建立了样品前处理及快速检测7种禁用着色剂的可靠定量方法。 试剂和样品 实验所用试剂和溶剂均为色谱纯或分析纯级。色谱纯乙腈、.日甲醇购于迪马公司，7种着色剂标准品(柠檬黄、桔黄、靛蓝、亮蓝、苋菜红、胭脂红和诱惑红)购于 Dr. Ehrenstorfer 公司，实验用水为 Millipore Milli-Q超纯水系统现制备的高纯去离子水，鸡配合饲料和鸡浓缩饲料样品为市售产品。 仪器和设备 Agilent 1260 Infinity 液相色谱系统，配人以下模块： - Agilent 1260 Infinity 二元泵(部件号 G4220A) - Agilent 1260 Infinity 标准自动进样器(部件号 G4226A) - Agilent 1260 Infinity 柱温箱(部件号G1316C) - Agilent 1260 Infinity 二极管阵列检测器(部件号 G4212A) 样品提取与净化 取 1.0(±0.1)g饲料样品于具塞离心管中，加10mL提取液(浓氨水：水：乙腈=2：48：50，v/v/v) 振摇提取2 min， 4℃ 8000 r/min离心10 min， 取5mL上清液至另一具塞离心管中并加10mL水混匀，用甲酸调节 pH至2.0， 4℃8000 r/min 离心10 min， 取上清液待净化。采用 Agilent Bond Elut PSA 固相萃取小柱(部件号12102042)进行净化，操作流程如图1所示。 液相色谱条件 色谱柱： Agilent Poroshell 120 EC-C18，4.6×100 mm， 2.7 pm(部件号695975-902) 柱温： 35°℃ 进样量： 10uL 流动相： A) 20 mmol/L 乙酸铵水溶液(用乙酸将 pH 调节至5.0) B)乙腈流速：1.0 mL/min 梯度洗脱： 时间 (min) B(%) 00 2 11.0 11.5 100 12.0 2 15.0 2 检测波长： 425nm柠檬黄 630 nm 靛蓝、亮蓝 500 nm 苋菜红、胭脂红、桔黄、诱惑红 标准曲线的绘制 以超纯水为溶剂，分别取一定量的着色剂标准品，配制得到浓度分别为0.5、2.5、5.0和20.0 pg/mL 的混合标准溶液。取 10 pL各种浓度的标准溶液进行测定，分别以7种着色剂在特定波长下的峰面积对浓度绘制标准曲线。 固相萃取方法优化 由于7种水溶性着色剂的化学结构中均含有芳香环结构和磺酸根基团(如图2)，因此本文分别考察了非极性、强阴离子交换和弱阴离子交换等三种固相萃取吸附模式，结果发现弱阴离子交换固相萃取在吸附强度和重现性方面表现最出色，故选择弱阴离子交换模式来萃取和净化禽饲料中的水溶性着色剂。为确保7种着色剂实现可靠的回收，本文针对提取液、活化液、上样液、淋洗液、洗脱液的 pH和离子强度均进行了细致的优化，最终确定的固相萃取流程如图1所示。 色谱条件选择 本文选择常用的十八烷基键合硅胶色谱柱进行液相色谱分离2，结果发现色谱柱填料是否封端以及流动动的pH 对7种着色剂(尤其是苋菜红、柠檬黄和胭脂红)的峰形影响显著，其原因可能在于强阴离子磺酸根容易导致次级相互作用。因此，最终选择经过充分封端的 Poroshell 120 EC-C18色谱柱，并将乙酸铵缓冲液的pH 调节至5.0，由此有效抑制了峰拖尾现象，使7种着色剂均可获得优异的峰形，同时提高了分离度。 检测波长的确定 通过二极管阵列检测器 (DAD) 全光谱采集，确定7种着色剂的最佳检测波长。结果发现，尽管7种着色剂在254 nm 波长下的响应较高，但基线波动和杂质峰干扰现象较明显，在可见波长下则具有更高的选择性。0.5 pg/mL 混合标准溶液的色谱图如图3所示，7种着色剂的最佳检测波长分别为：柠檬黄，425nm；靛蓝和亮蓝，630nm；苋菜红、胭脂红、桔黄和诱惑红，500 nm。 图3.0.5 pg/mL混合标准溶液普图 标准曲线与相关系数 本文所考察的7种着色剂在0.5-20.0 pg/mL 浓度范围内获得的标准曲线均表现出优异的线性，相应的线性回归方程和相关系数列于表1中。 表1.7种着色剂的线性回归方程和相关系数 分析物 线性回归方程 相关系数 R? 柠檬黄 v=20.081x-0.4442 1.0000 苋菜红 v=15.651x+0.0213 1.0000 靛蓝 y=13.691x+1.7609 0.9998 胭脂红 y=16.282x-0.4752 1.0000 桔黄 y=18.868x+0.0464 1.0000 诱惑红 y=20.493x+0.1990 1.0000 亮蓝 y=67.863x-0.0664 1.0000 本文考察了两种禽饲料(鸡配合饲料和鸡浓缩饲料)中7种着色剂在三个浓度水平下的加标回收率，结果列于表2和表3中。从表中可以看出，本文所开发的基于 Bond Elut PSA 的固相萃取方法对于7种着色剂具有良好的适用性，所得到的各种分析物的平均回收率处于68.3%-119.2%的范围内，且相对标准偏差为0.7%-10.0%(n=3)。 表2.鸡配合饲料中7种着色剂的加标回收率和相对标准偏差(n=3) 分析物 加标浓度(mg/kg) 平均回收率(%) 相对标准偏差(%) 柠檬黄 2 114.2 6.1 10 116.7 4.0 20 109.2 7.9 苋菜红 2 97.0 7.0 10 95.6 4.4 20 91.3 6.0 靛蓝 2 87.4 2.6 10 83.1 3.2 20 73.1 6.0 胭脂红 2 104.9 4.8 10 101.6 4.7 20 96.7 6.8 桔黄 2 118.1 5.9 10 119.2 4.7 20 110.3 8.7 诱惑红 2 113.9 5.6 10 112.2 3.3 20 105.4 8.8 亮蓝 2 117.9 5.9 10 115.8 6.1 20 105.4 8.9 表3.鸡浓缩饲料中7种着色剂的加标回收率和相对标准偏差(n=3) 分析物 加标浓度(mg/kg) 平均回收率(%) 相对标准偏差(%) 柠檬黄 2 112.9 1.0 10 111.4 8.0 20 114.4 0.6 苋菜红 2 83.4 1.2 10 69.4 7.9 20 68.3 1.0 靛蓝 2 88.3 3.2 10 79.9 10.0 20 77.4 7.2 胭脂红 2 106.3 0.9 10 94.0 8.4 20 94.3 0.8 桔黄 2 107.4 2.0 10 104.9 7.5 20 108.4 0.7 诱惑红 2 85.9 0.2 10 85.5 6.3 20 89.3 1.0 亮蓝 2 114.0 1.1 10 103.6 7.8 20 106.9 0.4 方法检测限 根据0.5 pg/mL 混合标准溶液的信噪比计算信噪比为3时的浓度，并根据样品前处理的稀释/浓缩倍数折算出7种着色剂的方法检测限。结果如表4所示，7种着色剂的检测限均处于0.019-0.083 mg/kg 的范围内，完全满足《食品安全国家标准食品中合成着色剂的测定》(GB 5009.35-2016)中对相关合成着色剂的检测限要求。 表4.7种着色剂的方法检测限 分析物 方法检测限(mg/kg) 柠檬黄 0.035 苋菜红 0.055 靛蓝 0.083 胭脂红 0.059 桔黄 0.049 诱惑红 0.046 亮蓝 0.019 本文采用 Bond Elut PSA 小柱建立了禽饲料中水溶性着色剂的固相萃取前处理方法，并结合 Poroshell 120 EC-C18 色谱柱快速分离和高效液相色谱多波长检测，实现了禽饲料中7种禁用水溶性着色剂的灵敏、快速、准确的定量分析。所开发的方法具有良好的准确度和精密度，且方法检测限低，能够满足未来相关法规监测的要求。 ( 参考文献 ) ( 1 . GB 5009.35-2016 《 《食品安全国家标准食品中合成着色剂的测定》 ) ( 2.刀 方晏燕，采用安捷伦 HC-C18 色谱柱对食品中合成着色剂的 测定，安捷伦应用文献5989-3639CHCN ) 安捷伦汉本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 ( 本文中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知。 ) ( ◎安捷伦科技(中国)有限公司，2018 ) 5991-8924ZHCN 摘要本文采用乙腈-氨水溶液提取、Agilent Bond Elut PSA 固相萃取小柱富集和净化、Agilent Poroshell 120 EC-C18 色谱柱快速分离，建立了同时检测禽饲料中 7 种禁用水溶性着色剂的液相色谱分析方法。该方法在 0.5-20 μg/mL 浓度范围内线性相关性良好，相关系数 R2 ≥ 0.998。对于鸡浓缩饲料和鸡配合饲料，加标浓度为 2.0、10.0、20.0 mg/kg 的 7 种着色剂的平均回收率均处于 68.3%-119.2% 的范围内，相对标准偏差为 0.7%-10.0% (n = 3)。7 种着色剂的方法检测限 ≤ 0.09 mg/kg，在 15 min 内即可完成快速分离与高灵敏度分析。前言合成着色剂通常由苯、甲苯、萘等化工原料经过一系列有机反应获得，以价格低廉、染色性能好且用量少等优点而得到广泛应用。近年来，在饲料中添加合成着色剂以改善畜产品肉质颜色的现象经常出现，可能危及消费者的健康和安全。为加强对饲料安全的监管，农业部第 1126 号公告明确规定了禽饲料中允许和禁止添加的合成着色剂名单，但尚未发布配套的标准检测方法。针对相关禽类饲料中禁用合成着色剂的检测需求，本文采用 Agilent 1260 液相色谱系统和Agilent Bond Elut PSA 固相萃取小柱，建立了样品前处理及快速检测 7 种禁用着色剂的可靠定量方法。结论本文采用 Bond Elut PSA 小柱建立了禽饲料中水溶性着色剂的固相萃取前处理方法，并结合 Poroshell 120 EC-C18 色谱柱快速分离和高效液相色谱多波长检测，实现了禽饲料中 7 种禁用水溶性着色剂的灵敏、快速、准确的定量分析。所开发的方法具有良好的准确度和精密度，且方法检测限低，能够满足未来相关法规监测的要求。