冰淇淋和火腿肠中水溶性着色剂检测方案(液相色谱仪)

应用简报 Agilent食品检测与农业Trusted Answers 采用固相萃取-高效液相色谱法测定食品中的水溶性着色剂 ( 刘明艳 ) 北京市海淀区产品质量监督检验所 吴华、吴翠玲、黄悯嘉 安捷伦科技(中国)有限公司 本文采用乙腈-氨水溶液提取、Agilent Bond Elut PSA 固相萃取小柱富集和净化、AgilentPoroshell 120 EC-C18 色谱柱快速分离，建立了同时检测食品中9种常用水溶性着色剂的液相色谱分析方法。该方法在 2.5-50 pg/mL 浓度范围内线性相关性良好，相关系数R>0.9998。对于冰淇淋和火腿肠这两种基质，加标浓度为2.5 mg/kg 和 5.0 mg/kg 的9种着色剂的平均回收率均处于 62.0%-117.3%的范围内，相对标准偏差为0.4%-19.9%(n=3)。9种着色剂的方法检测限s0.083 mg/kg， 在 15 min 内即可完成快速分离与高灵敏度分析。 合成着色剂通常由苯、甲苯、萘等化工原料经过一系列有机反应获得，以价格低廉、染色性能好且用量少等优点而广泛应用于加工食品。对于加工食品中的着色剂，我国现行限量标准和检测方法分别为《食品安全国家全准食品添加剂使用标准》 (GB 2760-2014)和《食品安全国家标准食品中合成着色剂的测定》 (GB5009.35-2016)。其中 GB 5009.35-2016规定的样品前处理方法包括聚酰胺吸附法和液-液分配法，这两种方法操作过程繁琐，且对高脂肪、高蛋白的样品提取效果不佳。 本文采用 Agilent Bond Elut PSA 固相萃取小柱建立了食品中常用水溶性着色剂的样品前处理方法，在对冰淇淋和火腿肠样品中的9种水溶性着色剂的分析中获得了良好的结果。 试剂和样品 实验所用试剂和溶剂均为色谱纯或分析纯级。色谱纯乙腈、甲醇购于迪马公司，9种着色剂标准品1((柠檬黄、桔黄、靛蓝、亮蓝、苋菜红、胭脂红、诱惑红、新红和酸性红)购于Dr. Ehrenstorfer 公司，实验用水为 Millipore Milli-Q 超纯水系统现制备的高纯去离子水。冰淇淋和火腿肠样品为市售产品。 仪器和设备 Agilent 1260 Infinity 液相色谱系统，配人以下模块： - Agilent 1260 Infinity 二元泵(部件号 G4220A) - Agilent 1260 Infinity 标准自动进样器(部件号 G4226A)- Agilent 1260 Infinity 柱温箱(部件号G1316C) - Agilent 1260 Infinity 二极管阵列检测器(部件号 G4212A) 样品提取与净化 取1.0(±0.1)g食品样品于具塞离心管中，加10mL提取液(浓氨水：水：乙腈=2：23：75， v/v/v) 振摇提取2 min， 4℃ 8000 r/min离心10min， 取5mL上清液至另一具塞离心管中并加10mL水混匀，用甲酸调节 pH至2.0，4℃8000 r/min 离心 10 min， 取上清液待净化。采用 Agilent Bond Elut PSA 固相萃取小柱(部件号12102042)进行净化，操作流程如图1所示。 图1.固相萃取操作流程 液相色谱条件 色谱柱： Agilent Poroshell 120 EC-C18，4.6×100 mm， 2.7 pm(部件号695975-902) 柱温： 35°℃ 进样量： 10uL 流动相： A) 20mmol/L 乙酸铵水溶液(用乙酸将pH调节至5.0) B)乙腈 流速： 1.0 mL/min 00 梯度洗脱： 时间 (min)B((9%)23 11.0 11.5 100 12.0 2 15.0 2 检测波长： 425nm柠檬黄 630nm 靛蓝、亮蓝 500 nm 新红、苋菜红、胭脂红、桔黄、诱惑红、 酸性红 标准曲线的绘制 以超纯水为溶剂，分别取一定量的着色剂标准品，配制得到浓度分别为2.5、5.0、10.0、25.0和 50.0 pg/mL的混合标准溶液。取10pL 各种浓度的混合标准溶液进行测定，分别以9种着色剂在特定波长下的峰面积对浓度绘制标准曲线。 提取液优化 本文采用乙腈比例较高的碱性溶液(浓氨水：水：乙腈=2：23：75，v/v/v)提取冰淇淋和火腿肠中的水溶性着色剂，以便获得最高的提取效率。如果待测食品中的油脂含量不高，也可适当调整为采用水比例更高的提取液。 固相萃取方法优化 由于9种水溶性着色剂的化学结构中均含有芳香环结构和磺酸根基团，因此本文分别考察了非极性、强阴离子交换和弱阴离子交换三种固相萃取吸附模式，结果发现弱阴离子交换固相萃取在吸附强度和重现性方面表现最出色，故选择弱阴离子交换模式来萃取和净化食品中的水溶性着色剂。为确保9种着色剂实现可靠的回收，本文针对提取液、活化液、上样液、淋洗液、洗脱液的 pH 和离子强度均进行了细致的优化，最终确定的固相萃取流程如图1所示。 色谱条件选择 本文选择常用用十八烷基键合硅胶色谱柱进行液相色谱分离2、3、4，结果发现色谱柱填料是否封端以及流动相的 pH对着色剂(尤其是苋菜红、柠檬黄和胭脂红)的峰形影响显著，其原因可能在于强阴离子磺酸根容易导致次级相互作用。因此，最终选择经过充分封端的 Poroshell 120 EC-C18色谱柱，并将乙酸铵缓冲液的 pH调节至5.0，由此有效抑制了峰拖尾现象，使9种着色剂均可获得优异的峰形，同时提高了分离度。 检测波长的确定 通过二极管阵列检测器全光谱采集，确定9种着色剂的最佳检测波长。结果发现，尽管9种着色剂在 254 nm 波长下的响应较高，但基线波动和杂质峰干扰现象较明显，在可见波长下则具有更高的选择性。o1.25ug/mL 混合标准溶液的色谱图如图2所示，9种着色剂的最佳检测波长分别为：柠檬黄，425nm；靛蓝和亮蓝，630 nm；新红、苋菜红、胭脂红、桔黄、诱惑红和酸性红，500 nm. 图2.1.25 pg/mL 混合标准溶液的谱图 校正曲线与相关系数 本文所考察的9种着色剂在2.5-50.0 pg/mL 浓度范围内获得的标准曲线均表现出优异的线性，相应的线性回归方程和相关系数列于表1中。 表1.9种着色剂的线性回归方程和相关系数 分析物 线性回归方程 相关系数R? 柠檬黄 v=14.177x-0.6273 0.9999 新红 v=11.501x-0.2406 1.0000 苋菜红 y=14.597x+0.5412 0.9999 靛蓝 v=2.2773x+0.0539 0.9999 胭脂红 v=13.127x-0.0272 1.0000 桔黄 v=10.837x+0.087 1.0000 诱惑红 v=5.8838x+0.0956 1.0000 酸性红 v=10.866x+0.2159 1.0000 亮蓝 v=47.193x+7.2262 0.9998 加标回收率 本文考察了两种高油脂食品(冰淇淋和火腿肠)中的9种着色剂在两个浓度水平下的加标回收率，结果列于表2和表3中。从表中可以看出，本文所开发的基于 Bond Elut PSA 的固相萃取方法对于9种着色剂具有良好的适用性，所得到的各种分析物的平均回收率处于62.0%-117.3%的范围内，且相对标准偏差为0.4%-19.9%(n=3)。 表2.冰淇淋中9种着色剂的加标回收率和相对标准偏差(n=3) 表3.火腿肠中9种着色剂的加标回收率和相对标准偏差(n=3) 分析物 加标浓度(mg/kg) 平均回收率(%) 相对标准偏差(%) 柠檬黄 2.5 105.0 3.4 5.0 83.6 19.9 新红 2.5 98.7 2.1 5.0 80.2 1.8 苋菜红 2.5 109.5 4.1 5.0 97.5 2.6 靛蓝 2.5 87.2 3.4 5.0 82.4 1.8 胭脂红 2.5 109.0 4.3 5.0 98.3 1.5 橘黄 2.5 113.7 4.3 5.0 103.0 4.6 诱惑红 2.5 116.1 4.9 5.0 110.2 8.8 酸性红 2.5 95.4 1.9 5.0 117.3 11.1 亮蓝 2.5 107.0 3.4 5.0 101.7 5.2 分析物 加标浓度(mg/kg) 平均回收率(%) 相对标准偏差(%) 柠檬黄 2.5 75.6 4.9 5.0 88.8 6.4 新红 2.5 77.2 9.2 5.0 87.3 0.4 苋菜红 2.5 81.5 6.9 5.0 91.6 9.0 靛蓝 2.5 62.0 5.5 5.0 74.7 6.1 胭脂红 2.5 85.2 5.2 5.0 96.4 7.4 橘黄 2.5 95.1 6.0 5.0 104.5 8.8 诱惑红 2.5 92.7 1.2 5.0 103.4 6.2 酸性红 2.5 65.1 15.0 5.0 94.6 3.1 亮蓝 2.5 92.1 5.9 5.0 103.7 7.8 方法检测限 表4.9种着色剂的方法检测限 根据 0.5 pg/mL 混合标准溶液的信噪比计算信噪比为3时的浓度，并根据样品前处理的稀释/浓缩倍数折算出9种着色剂的方法检测限。结果如表4所示，9种着色剂的方法检测限均处于0.019-0.083 mg/kg 的范围内，完全满足 GB 5009.35-2016中对相关合成着色剂的检测限要求。 分析物 方法检测限(mg/kg) 柠檬黄 0.035 新红 0.036 苋菜红 0.055 靛蓝 0.083 胭脂红 0.059 桔黄 0.049 诱惑红 0.046 酸性红 0.066 亮蓝 0.019 本文采用 Bond Elut PSA 小柱建立了高油脂食品中水溶性着色剂的固相萃取前处理方法，并结合 Poroshell 120 EC-C18 色谱柱快速分离和高效液相色谱多波长检测，实现了冰淇淋和火腿肠中9种限用水溶性着色剂的灵敏、快速、准确的定量分析。所开发的方法具有良好的准确度和精密度，且方法检测限低，能够满足未来相关监测法规的要求。 ( 参考文献 ) ( 1 . GB 2760-2014 《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》 ) ( 2.6 GB 5009.35-2016 《食品安全国家标准食品中合成着色剂的测定》 ) ( 3.蒲云霞、王春辉、杨剑业等，反相高效液相色谱法检测熟肉 制品中的合成色素，中国卫生检验杂志，2009，19(6)： 1414-1415 ) ( 4. 方晏燕，采用安捷伦 HC-C18 色谱柱对食品中合成着色剂的测定，安捷伦应用文献5989-3639CHCN ) 安捷伦汉本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 ( 本文中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知。 ) ( ◎安捷伦科技(中国)有限公司，2018 ) 5991-8925ZHCN 摘要本文采用乙腈-氨水溶液提取、Agilent Bond Elut PSA 固相萃取小柱富集和净化、Agilent Poroshell 120 EC-C18 色谱柱快速分离，建立了同时检测食品中 9 种常用水溶性着色剂的液相色谱分析方法。该方法在 2.5-50 μg/mL 浓度范围内线性相关性良好，相关系数 R2 ≥ 0.9998。对于冰淇淋和火腿肠这两种基质，加标浓度为 2.5 mg/kg 和 5.0 mg/kg 的 9 种着色剂的平均回收率均处于 62.0%-117.3% 的范围内，相对标准偏差为 0.4%-19.9% (n = 3)。9 种着色剂的方法检测限 ≤ 0.083 mg/kg，在 15 min 内即可完成快速分离与高灵敏度分析。前言合成着色剂通常由苯、甲苯、萘等化工原料经过一系列有机反应获得，以价格低廉、染色性能好且用量少等优点而广泛应用于加工食品。对于加工食品中的着色剂，我国现行限量标准和检测方法分别为《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》(GB 2760-2014) 和《 食品安全国家标准 食品中合成着色剂的测定》(GB 5009.35-2016)。其中 GB 5009.35- 2016 规定的样品前处理方法包括聚酰胺吸附法和液-液分配法，这两种方法操作过程繁琐，且对高脂肪、高蛋白的样品提取效果不佳。本文采用 Agilent Bond Elut PSA 固相萃取小柱建立了食品中常用水溶性着色剂的样品前处理方法，在对冰淇淋和火腿肠样品中的 9 种水溶性着色剂的分析中获得了良好的结果。结论本文采用 Bond Elut PSA 小柱建立了高油脂食品中水溶性着色剂的固相萃取前处理方法，并结合 Poroshell 120 EC-C18 色谱柱快速分离和高效液相色谱多波长检测，实现了冰淇淋和火腿肠中 9 种限用水溶性着色剂的灵敏、快速、准确的定量分析。所开发的方法具有良好的准确度和精密度，且方法检测限低，能够满足未来相关监测法规的要求。