红细胞中红细胞脂肪酸检测方案(气相色谱仪)

应用简报 Agilent临床研究Trusted Answers 临床研究中红细胞脂肪酸谱的测定化学电离气相色谱串联质谱仪 Yvonne Schober， Hans Gunther Wahl12， Harald Renz， Wolfgang Andreas Nockher 和 Carrie J. Adler° ( 1德国马尔堡菲利普大学检验医学和病理生物化学研究所 ) ( ‘ M edizinisches L abor W ahl， ) ( 德国吕登沙伊德 ) ( 安捷伦科技公司 ) ( 美国加利福尼亚州圣克拉拉 ) 细胞脂肪酸 (FA) 谱被公认为各种人类疾病的生物标记物，通常采用气相色谱质谱联用系统(GC/MS) 对其进行分析，而这种方法非常费时费力。因此临床研究中需要一种高通量的分析方法。在本研究中，从红细胞 (RBC)中提取 FA 后进行衍生化，以生成脂肪酸甲酯 (FAME)。采用氨气诱导化学电离(CI)的气相色谱串联质谱 (GC/MS/MS)FA 谱分析法专为人 RBC的分析而开发。有703个RBC 样品采用 GC/MS/MS 进行了FA 谱分析。将该分析方法与采用电子轰击电离(EI)的单杆 GC/MS 传统方法进行比较。氨气诱导 CI分析能够生成足够数量的分子离子，以对 FAME 进行进一步研究。该分析确定了45个 FA 谱的特定碎片，用于实现可靠的定量分析和碎裂。使用传统GC/MS 的典型分析时间长达60分钟，但该 GC/MS/MS 分析方法的运行时间仅为9分钟。分析的所有 FA 批间与批内变异小于10%。将氨气诱导 CI 与 GC/MS/MS分析相结合，可帮助临床研究实验室实现稳定、可靠的高通量 FA 谱分析。 为了测定临床研究实验室中的脂肪酸(FA)谱，需要灵敏的特异分析方法。过去分离FA谱采用的是气相色谱 (GC)结合火焰离子化检测器 (FID)，这个组合使研究人员能够分析不同基质中的单个 FA。质谱 (MS)的引入改善了这种分析方式，但传统 GC/MS分析需要长时间的色谱分离才能确保可靠的鉴定和定量。本研究开发并验证了一种用于红细胞 (RBC) 等生物样本中 FA 高通量分析的特异、快速而灵敏的分析方法。为此，使用化学电离 (CI)与气相色谱串联质谱 (GC/MS/MS) 结合来测定 FA。采用这些技术可得到过去使用 GC/MS 进行 FA分析的改进方法。 配备 CI 的 GC/MS/MS配置和参数 参数 值 仪器 配备分流/不分流进样口 (G3452-67000)的 Agilent 7890AGC (G3440A)配备化学电离(CI) 源的 Agilent 7000 MS/MS (G7010BA) 进样口温度 250℃ 离子源温度 250°℃ 四极杆温度 150°℃ 进样量 1pL 保留间隙柱 安捷伦5 m， 0.25 mm 无涂层预柱 分析柱 Agilent J&W CP-Sil 88 FAME 分析专用气相色谱柱，50 m×0.25 mm， 0.20 pm， 7 英寸柱架 (CP7488) 载气 氦气，2.2 mL/min CI试剂 氨气， 1.3 mL/min 柱温箱升温程序 50℃(保持1分钟)，以120°℃/min 升至70℃，以45°C/min升至175℃， 以 35℃/min 升至230°C(保持3.5分钟) 停止时间 9.00分钟 MS采集模式 MRM 模式 配备 EI 的 GC/MS配置和参数 参数 值 仪器 配备分流/不分流进样口 (G3452-67000) 的 Agilent7890A GC (G3440A)配备化学电子轰击(EI)离子源的 Agilent 5975C MS(G3243A) 进样口温度 230°℃ 传输线温度 230°C 四极杆温度 150°C 分析柱 Agilent J&W CP-Sil 88 FAME 分析专用气相色谱柱，100 m， 0.25 mm， 0.20 pm， 7英寸柱架 (CP7489) 载气 氦气，2.0mL/min 柱温箱升温程序 120°℃(保持5分钟)， 以5℃/min升至220°℃(保持5分钟)，以4℃/min 升至240°℃(保持10分钟) 停止时间 45.00分钟 MS 采集模式 SIM 模式 化学品与试剂 异丙醇、甲醇和己烷(GC级)购自 Fisher Scientific (Schwerte，Germany)。水(LC/MS级)和三氟化硼(BF)(14%甲醇溶液)购自 Sigma-Aldrich (Hamburg， Germany)。硫酸钠(NazSO4)购自 Merck (Darmstadt， Germany)。 ( 经认证的37种脂肪酸甲酯 (FAME) 混合物 (TraceCERT) 购自Sigma-Aldrich (Hamburg， Germ a ny)。另 一 种 FAME 混合物购自 NuChekPrep (Elysian， M N，USA)， 包括内标 C17：1 (十七碳烯酸甲酯)在内的所有其他 FAME 均购自 Larodan (Malmo， Sweden)。 ) ( 使用常规实验室分析提交的 EDTA 抗凝血液等分试样。按照 赫尔辛基宣言II”向受试者详细说明，并获得使用不具名实验室数据的知情同意。 ) FAME 分析的 MRM 参数 表1.分析物参数 样品前处理 为从血红细胞中提取 FA， 将 0.5 mL 全血和 10 mL 0.9%盐水混合，并在2500g 下离心5分钟。弃去上清液后，重复一次清洗步骤。之后加入1mL蒸馏水使细胞溶解，并在冰箱的低温条件中储存至少30分钟。然后将 FA 提取物与5mL内标(IS)溶液混合，并在2500 g 下离心5分钟。 IS 溶液含有0.2 mg/mL FAC17：1 己烷/异丙醇 (3：2)溶液以及3mL NazSo溶液(6.7%)。然后将己烷相转移到干净的玻璃管中并用氮气将样品蒸干。在分离FA时，加入1mL BF 甲醇溶液(14%)并在100°℃下温育10分钟进行酯化。然后，冷却至室温后，将1mL水和 3 mL己烷加入样品中，并在2500g下离心5分钟。将己烷相转移至干净的样品瓶中，用氮气蒸干。最终的FAME 样品溶于 250mL 完中中，可储存在-25°℃条件下。分析前将样品以1：20 的比例用己烷稀释。 数据分析 采用 Agilent MassHunter 软件进行数据采集 (Waldbronn，Germany)。为了对 FAME 进行正确鉴定和定量，用两个碎片离子，一个用于定量，另一个用于确认。校准标样中采用45种 FAME (表1)的混合物。将单个 FA浓度计算为评估的 FA 集合中 100%的相对百分比，或计算为绝对值。采用MassHunter 定量分析软件5.0和 MassHunter 定性分析软件5.0进行数据分析。使用分析物与内标的峰面积比值计算校准曲线。 方法参数 为了测定 GC/MS/MS分析方法的线性和准确性，使用了45种FAME 混标在己烷和混合人红细胞中的一系列稀释溶液。方法的准确性同样用45种 FAME 混标在三个不同浓度范围内进行评估。为了评估批内精度，对一份人血液混合样品的 10个等分独立样品进行分析。以相同方式测定批间精度，但将样品分散在不同天中测定。使用在分析当天配制的校准标样测定浓度。计算精度的相对标准偏差(RSD)。对人血样品的分析灵敏度重复测定 10次。根据所选分析物的信噪比 (S/N) 计算检测限(LOD)和定量下限 (LLOQ)。使用 MassHunter 定性分析软件计算信噪比。 GC/MS分析 为比较 El和CI两种电离方法，在 FAME 分析中展示了二十二碳六烯酸甲酯 (DHA， C22：6n3) 的谱图。图1A中，采用El的 GC/MS 谱图显示出大量低质量数碎片。m/z=67、m/z=79和 m/z= 99 等某些碎片是 LC-PUFA 的特征性碎片，而这些碎片不具有化合物特异性。采用El 碎裂方式后，通常无法检出 FAME 的分子离子。相反，采用CI时， GC/MS 谱图中主要的峰为分子离子([M+H]*)， m/z=343(图1B)。氨气用作CI的反应气，因此其他的主要峰为氨加合离子([M+NH]*)，m/z=360。两种碎片都具有化合物特异性，因为 MS/MS 模式中消耗的氨 ([M+NH]+→[M+H]*)可用作定量离子对。 ×103 由于只有质子亲和力足够强的分析物能够被电离，与El电离模式相比，CI电离模式可降低化学背景浓度。 采用CI以及 MRM 模式下的 GC/MS/MS 是专为 FA分析优化的方法，可在9分钟内完成分析。表1显示分析物特异参数。为实现正确的鉴定与定量，对母离子、保留时间以及定 性和定量碎片离子进行了测定。图2显显出无明显背景峰。图2A 为 FAME 标样的 GC/MS/MS 色谱图。图2B和图2C为放大的两部分重叠峰。图2B显示了3个轻微重叠的分析物信号，而图 2C为两个完全重叠的分析物离子示例。未发现妨碍分析物定量的干扰峰。 ×104 图 2.A) 45种 FAME 的 GC/MS/MS色谱图B)6.5-6.7分钟间的放大色谱图以及对应的定量离子对。C) 7.1-7.3分钟间的放大色谱图以及对应应定量离子对 方法验证 为获得 GC/MS/MS方法的线性，对浓度由 5 ng/mL到20 mg/mL 的一系列 FAME 混标稀夜溶液进行分析。所有分析物的相关系数 (R²)均高于0.995。还对基质中45种 FAME 的系列稀释溶液进行了测定。所有分析物的R²均高于 0.992，并且未发现基质干扰。另外，还使用三种不同浓度的 FAME 标样对准确度、LOD 和 LLOQ进行了评估。所有分析物的准确度均在90%-110%间， LOD 和 LLOQ 均低至 ng/mL 级(表2)。将 10 种 FA 溶于10倍的人RBC 混合样品中进行测定，通过计算 RSD 获得精度结果。10种选定 FA 的批内与批间 RSD 均低于10%(表2)。 脂肪酸 日内 日间 LOD LOQ 均值 RSD 均值 RSD ng/mL ng/mL C16：0 25.2 ±1.4 5.3 25.7 ±2.1 8.0 6.3 ±1.5 20.8 ±2.1 C18：0 15.9 ±0.7 4.7 15.0 ±0.8 5.4 4.9 ±1.2 16.3 ±2.0 C18：1顺式 18.2 ±0.8 4.5 19.5 ±1.0 5.3 4.2 ±0.5 13.6 ±1.6 C18：2顺式 10.7 ±0.3 2.6 11.8 ±0.3 2.4 4.6 ±0.4 15.2 ±1.2 C20：3n6 1.5 ±0.1 5.3 1.6 ±0.1 6.5 0.9 ±0.1 2.7 ±0.8 C20：4n6 17.3 ±0.9 5.1 15.8 ±1.6 10.0 0.9 ±0.1 3.1 ±0.4 C20：5n3 0.4 ±0.1 7.1 0.5 ±0.1 8.7 1.9 ±0.2 5.9 ±0.8 C22：4n6 3.5 ±0.3 8.5 3.7 ±0.3 9.0 1.3 ±0.1 4.3 ±0.8 C22：5n3 2.2 ±0.2 9.1 2.0 ±0.2 8.6 1.6 ±0.2 5.3 ±0.9 C22：6n3 4.1 ±0.3 6.2 4.1 ±0.3 7.8 2.2 ±0.2 7.3 ±1.1 本研究开发了一种用于测定从衍生化到 FAME 的整个过程生物基质中 FA 谱的 GC/MS/MS 分析方法。方法可在9分钟内完成 45种FA谱的定量分析，并有良好的分析灵敏度与选择性。同时研究了其他参数，包括样品前处理步骤、方法稳定性以及 GC 和 MS/MS 条件。可认为该方法稳定且分析时间短，对FA分析有很广泛的适用性。 1.Boecking， C.； et al. Development and validation of acombined method for the biomonitoring of omega-3/-6fatty acids and conjugated linoleic acids in differentmatrices from human and nutritional sources， Clin.Chem. Lab. Med.2010，48，1757-1763 2. Dodds，E. D.； et al. Gas chromatographic quantificationof fatty acid methyl esters： flame ionization detectionvs. electron impact mass spectrometry， Lipids 2005，40，419-428 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 仅限研究使用。不可用于诊断目的。 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 ( ◎安捷伦科技(中国)有限公司，2018 ) ( 2018年3月8日，中国出版 ) 摘要细胞脂肪酸 (FA) 谱被公认为各种人类疾病的生物标记物，通常采用气相色谱质谱联用系统 (GC/MS) 对其进行分析，而这种方法非常费时费力。因此临床研究中需要一种高通量的分析方法。在本研究中，从红细胞 (RBC) 中提取 FA 后进行衍生化，以生成脂肪酸甲酯 (FAME)。采用氨气诱导化学电离 (CI) 的气相色谱串联质谱 (GC/MS/MS) FA 谱分析法专为人 RBC 的分析而开发。有 703 个 RBC 样品采用 GC/MS/MS 进行了FA 谱分析。将该分析方法与采用电子轰击电离 (EI) 的单杆 GC/MS 传统方法进行比较。氨气诱导 CI 分析能够生成足够数量的分子离子，以对 FAME 进行进一步研究。该分析确定了 45 个 FA 谱的特定碎片，用于实现可靠的定量分析和碎裂。使用传统 GC/MS 的典型分析时间长达 60 分钟，但该 GC/MS/MS 分析方法的运行时间仅为 9 分钟。分析的所有 FA 批间与批内变异小于 10%。将氨气诱导 CI 与 GC/MS/MS 分析相结合，可帮助临床研究实验室实现稳定、可靠的高通量 FA 谱分析。前言为了测定临床研究实验室中的脂肪酸 (FA) 谱，需要灵敏的特异分析方法。过去分离 FA 谱采用的是气相色谱 (GC) 结合火焰离子化检测器 (FID)，这个组合使研究人员能够分析不同基质中的单个 FA。质谱 (MS) 的引入改善了这种分析方式，但传统 GC/MS 分析需要长时间的色谱分离才能确保可靠的鉴定和定量。本研究开发并验证了一种用于红细胞 (RBC) 等生物样本中 FA 高通量分析的特异、快速而灵敏的分析方法。为此，使用化学电离 (CI) 与气相色谱串联质谱 (GC/MS/MS) 结合来测定 FA。采用这些技术可得到过去使用 GC/MS 进行 FA 分析的改进方法。结论本研究开发了一种用于测定从衍生化到 FAME 的整个过程生物基质中 FA 谱的 GC/MS/MS 分析方法。方法可在 9 分钟内完成 45 种 FA 谱的定量分析，并有良好的分析灵敏度与选择性。同时研究了其他参数，包括样品前处理步骤、方法稳定性以及 GC 和 MS/MS 条件。可认为该方法稳定且分析时间短，对 FA 分析有很广泛的适用性。