间三氟甲基苯丙醇，杂质I中分离纯化检测方案(液相色谱柱)

间三氟甲基苯丙醇和杂质I的分离 客户提供了间三氟甲基苯丙醇和相关杂质I，并反馈曾尝试使用反相C18柱对两化合物进行分离，但未能得到基线分离结果。现客户希望本实验室选择合适色谱柱并对色谱条件进行优化，来实现间氟甲基苯丙醇和其相关杂质l的基线分离。 首先，我们尝试使用中等极性的 CAPCELL PAK C18 MGII 色谱柱，在磷酸盐-乙腈体系中分析 50 pg/mL的混标溶液及各单标溶液，通过调整流动相中水相和有机相比例为 60：40时， 50 pg/mL 的混标溶液中，间三氟甲基苯丙醇和杂质1能实现基线分离，分离度为1.52(见图1)。同客户沟通，客户希望供试品溶液(当间三氟甲基苯丙醇浓度为 1 mg/mL， 杂质1为1 pg/mL)中两化合物分离度大于1.50。 图1MGII分析混标及单标溶液结果 HPLC Conditions ： 色谱柱：三：CAPCELL PAK C18 MGII S5； 4.6 mmi.d. ×250 mm (A4AD 11967) 流动相： 0.01 mol/L磷酸二氢铵(用氨水调pH至5.8))/乙腈=60/40 流1.0 mL/min 温 检 40C PDA220 nm 进样量： 混标示液20pL， 单标溶液各1 pL 样 品： 混标溶液 50pg/mL，单标溶液各 1 mg/mL (50%乙腈稀释) 在此实验基础上，进一步分析供试品溶液，结果发现由于间三氟甲基苯丙醇浓度过高，致使色谱峰展宽，杂质1与间三氟甲基苯丙醇的分离度下降，未能达到1.50的基线分离要求；进一步尝试通过升高高温来改善分离度，结果如图2， 在50℃时能够得到良好分离结果，分离度为1.59。 图2MGII分析混标及单标溶液结果 注： 峰上标数字为分离度。 HPLC Conditions ： 色谱柱： CAPCELL PAK C18 MGII S5； 4.6 mm i.d.×250 mm (A4AD 11967) 流动相： 0.01 mol/L 磷酸二氢铵(用氨水调pH至5.8)3)/乙腈=60/40 流1.0 mL / min温 检 40°C/45C/50°C PDA220 nm 进样量： 20pL 样品： 间三氟甲基苯丙醇1mg/mL，杂质为1g/mL (50%乙稀释) 为有更多的选择，我们也尝试了两款非C18色谱柱，包括键合特殊官能团——金刚烷基的高极性色谱柱ADME 和键合五氟苯基的 PFP 色谱柱。在使用 PFP色谱柱分析 50 pg/mL 混标溶液时，发现两化合物峰重合，未能实现分离。但使用 ADME 分析混标溶液时，能够得到1.36的分分度(见图3)。 图3 PFP、ADME分析50 pg/mL混标溶液结果 注： 峰上标数字为分离度。 HPLC Conditions ： 色谱柱：CAPCELL PAK PFP S5； 4.6mm i.d. ×250 mm CAPCELL PAK ADME S5； 4.6 mmi.d.×250 mm 流动相： 0.01 mol/L磷酸二氢铵(用氨水调pH至5.8) /乙腈=60/40 流流 1.0 mL/ min温检 40°C PDA 220nm 进样量：20pL 样 品：混标溶液50 pg/mL (50%乙腈稀释) 尝试改善分离度，继续使用 ADME 色谱柱进行分析，通过降低有机相比例来延长保留，最终得到了 1.50的分离度(见图4)，与此同时对供试品溶液进行分析，发现由于主成分峰展宽未能得到基线分离结果(见图5)。 图4ADME分析混标溶液结果 图5ADME分析供试品溶液结果 注： 峰上标数字为分离度。 HPLC Conditions ： 色谱柱：CCAPCELL PAK ADME S5； 4.6 mm i.d.×250 mm 流动相： 0.01 mol/L 磷酸二氢铵(用氨水调pH至5.8) /乙腈=65/35 流 1.0 mL / min 温40°℃ 检PDA220nm 进样量： 20pL 样品：混标溶液50 ug/mL，供供品溶液(间三氟甲基苯丙醇1 mg/mL， 杂质为 1 ug/mL) (50%乙腈稀释) 综上实验结果，使用中等极性色谱柱 CAPCELL PAK C18 MGII S5； 4.6 mm i.d. × 250 mm (A4AD11967)，在流动相条件为 0.01 mol/L 磷酸二氢铵(用氨水调pH至5.8)/ 乙腈=60/40、柱温为50℃时进行分析，能够在间三氟甲基苯丙醇浓度为 1 mg/mL， 杂质1为 1 ug/mL情况下，满足两化合物间分离度大于1.50的要求。 LC Application Lab， Sanyofine China No.22， HLS Business Park， 14 kechuang Street， Economic Technological Development Zone， Beijing， China 100176 Phone 400 801 3103 客户提供了间三氟甲基苯丙醇和相关杂质I，并反馈曾尝试使用反相C18柱对两化合物进行分离，但未能得到基线分离结果。本实验室进行色谱柱筛选及色谱条件优化，最终，使用中等极性色谱柱CAPCELL PAK C18 MGII S5; 4.6 mm i.d. × 250 mm，能够在间三氟甲基苯丙醇浓度为1 mg/mL，杂质I为1 μg/mL情况下，满足两化合物间分离度大于1.50的要求，实现了间氟甲基苯丙醇及其相关杂质I的基线分离。