头孢克洛及9种杂质中有关物质检测方案(液相色谱柱)

头孢克洛及9种杂质的分析 头孢克洛 (cefaclor) 为白色至微黄色粉末或结晶性粉末的化学品，微臭，本品在水中微溶，在甲醇、乙醇、三氯甲烷或二氯甲烷中几乎不溶，分子式：C15H14CIN3O4S。 头孢克洛是β-内酰胺类抗生素，头孢菌素类药，是第二代头孢菌素，主要适用于敏感菌所致的急性咽炎、急性扁桃体炎、中耳炎、支气管炎、肺炎等呼吸道感染、皮肤软组织感染和尿路感染等。 M.W.： 367.81 本实验对客户提供的头孢克洛原料药以及9种杂质(杂质A、B、C、D、E， 7-ACCA， 头孢克洛6-3异构体，α-苯甘氨酸，苯甘氨酸甲酯盐酸盐)进行分析，希望得到杂质混合对照溶液及供试品溶液中各杂质的良好分离。 客户反馈，将流动相磷酸盐体系的 pH值由4.0提高提4.5可得到杂质混合对照溶液中 7-ACCA和 a-苯甘氨酸之间的良好分离，但头孢克洛与其相邻杂质E 峰之间分离较难。 客户前期使用了 CAPCELL PAK C18 MGII S3； 4.6 mm i.d.×250 mm 色谱柱进行分析，在此基础上，我们尝试了其他填料的几款色谱柱进行分离尝试，分别为 CAPCELL PAK C18 C18 AQ (S3 & S5)、CAPCELL PAK ADME (金刚烷基)、SUPERIOREX ODS、CAPCELL PAK PFP (五氟苯基)、CAPCELLPAK CN(氰基)。 图11AQ S3分析杂质混合对照溶液结果 1.a-苯甘氨酸2.7-ACCA 3.杂质A 4.杂质B5.苯甘氨酸甲酯盐酸盐 6.杂质C7.头孢克洛6-3异构体 8.头孢克洛各99.杂质E110.杂质D HPLC Conditions 色谱： CAPCELL PAK C18 AQ S3； 4.6 mm i.d.×250mm (柱号： A7AD 01509) 流动相：A：磷酸缓冲盐*B：磷酸缓冲盐*/乙腈=55/45 B% 5% (0min)-25% (30min)→100% (45min)→100% (50min)→5%(51min)→5%(61min) 流速：1.0mL/min (系统压+柱压：20.5MPa)温检浓 度：20℃ 测： PDA 220nm 度：10 pg/mL 进样量：20pL *磷酸缓冲盐：0.78%磷酸二氢钠溶液，以磷酸调节 pH为 4.5 进一步分析供试品溶液，如图2，由于样品浓度较高，导致头孢克洛主峰向后展宽，进而将杂质E包于其中。 图2 AQS3分析供试品溶液结果 为使头孢克洛和杂质E之间得到更好的分离，我们尝试对色谱条件进行调整。 1.调整主温 首先对温度进行调整：实验过程中发现柱温对头孢克洛与杂质E的出峰行为有较大影响——当柱温设置为20℃时，头孢克洛和杂质E 之间能够得到良好分离；将温度提高到30℃时，杂质E 向前移动趋势较大。为使杂质E峰出在头孢克洛峰前，避免由于供试品中头孢克洛峰的展宽而使杂质E被包于其内，进一步将柱温提高到40℃， 发现头孢克洛与杂质E峰重合；最终，将柱温提高到45℃， 此时杂质E峰移至头孢克洛峰前，但未能得到理想的分离结果。 E 图3不同柱温条件下 AQS3 分析杂质混合对照溶液结果 2.调整流动相 考虑到提高柱温对色谱柱寿命的影响，仍选择初始使用的20℃，对流动相梯度条件进行调整。在增强整体保留时间的同时，发现头孢克洛和杂质E的出峰顺序发生了颠倒，且分离良好，进而有效避免了杂质E被包于头孢克洛主峰中的问题；而在主峰后出峰的杂质D 与头孢克洛之间分离度亦较高，即使供试品溶液中的头孢克洛峰展宽，也不会出现将杂质D包于其中的问题。 因此我们在此梯度条件下进一步对供试品溶液进行分析，如图4，头孢克洛与各杂质峰之间均能得到良好的分离结果。 图4 AQ S3分析杂质混合对照溶液及供试品溶液结果(调整梯度) 1.α-苯甘氨酸 2.7-ACCA 3.杂质A4.杂质B5.苯甘氨酸甲酯盐酸盐66.杂质C7.头孢克洛6-3异勾体 8.杂质E：9.头孢克洛10.杂质D HPLC Conditions 色谱柱： CAPCELL PAK C18 AQ S3； 4.6 mm i.d.×250 mm (柱号： A7AD 01509) 流动相：A：磷酸缓冲盐**B：磷酸缓冲盐*/乙腈=55/45 B% 5% (0min)→5% (5min)→25% (45min)→100% (55min)→100% (60min)→5% (60.1min)速：1.0 mL / min 流温度：20℃检浓 测： PDA 220nm 度：杂质混合对照溶液 10 pg/mL， 供试品溶液 5 mg/mL 进样量： 20pL *磷酸缓冲盐：0.78%磷酸二氢钠溶液，以磷酸调节 pH 为 4.5 为使客户有更多的色谱柱选择，本实验室也尝试使用键合金刚烷基的高极性色谱柱 CAPCELL PAKADME 分析杂质混合对照溶液和供试品溶液，如图5，在分析杂质混合对照溶液时，能够得到各组分的良好分离，同时发现杂质E和头孢克洛出峰顺序发生颠倒，但同时也发现头孢克洛峰与其后相邻杂质D峰之间分离度较低 (Rs=1.71)；因此，如图6，在分析供试品溶液时，由于色谱峰向后展宽，使得杂质D 被包 于头孢克洛主峰中，未能得到理想分离结果。 图5 ADME 分析杂质混合对照溶液结果 1.a-苯甘氨酸2.7-ACCA 3.杂质A4.杂质B5.苯甘氨酸甲酯盐酸盐6.杂质C7.头孢克洛6-3异构体8.杂质E9.头孢克洛10.杂质D 图6 ADME 分析杂质混合对照溶液结果 HPLC Conditions 色谱柱： CAPCELL PAK ADME S5； 4.6 mm i.d.×250mm 流动相：A：磷酸缓冲盐*B：磷酸缓冲盐*/乙腈=55/45 B% 5%(0min)→25% (30min)→100% (45min)→100%(50min) →5% (51min)→5% (61min) 流速：1.0 mL/ min温检浓 度：20℃ 检测： PDA220nm 度：10 pg/mL 进样量：20uL *磷酸缓冲盐：0.78%磷酸二氢钠溶液，以磷酸调节 pH为4.5 之后，我们也尝试使用了 CN (氰基柱)和PFP(五氟苯基)以及高碳载量的SUPERIOREX ODS色谱柱，在客户提供的色谱条件下对杂质混合对照溶液进行分析，均未能得到更理想的分离结果。 综上实验结果，使用能在100%水相条件下稳定使用的高极性C18色谱柱 CAPCELL PAK C18 AQ S3；4.6 mm i.d.×250 mm 色谱柱，通过调整梯度条件来增强保留，最终实现了头孢克洛杂质混合对照溶液及供试品溶液中所有物质的良好保留与分离结果。 三耀精细化工品销售(中国)有限公司 技术开发部 地址：北京经济技术开发区宏达南路5号 宏达利德工业园1栋418室 邮编：100176 大阪曹達集团耀精细化工品销售(北京)有限公司 头孢克洛及9种杂质的分析 头孢克洛（cefaclor）为白色至微黄色粉末或结晶性粉末的化学品，微臭，本品在水中微溶，在甲醇、乙醇、三氯甲烷或二氯甲烷中几乎不溶，分子式 :C15H14ClN3O4S。头孢克洛是β-内酰胺类抗生素，头孢菌素类药，是第二代头孢菌素，主要适用于敏感菌所致的急性咽炎、急性扁桃体炎、中耳炎、支气管炎、肺炎等呼吸道感染、皮肤软组织感染和尿路感染等。头孢克洛M.W.: 367.81使用能在100%水相条件下稳定使用的高极性C18色谱柱CAPCELL PAK C18 AQ S3; 4.6 mm i.d. × 250 mm色谱柱，通过调整梯度条件来增强保留，最终实现了头孢克洛杂质混合对照溶液及供试品溶液中所有物质的良好保留与分离结果。