血浆中候选药物混合物的定量分析检测方案(液相色谱仪)

thermoscientific 实验热线8008105118电话4006505118www.thermofisher.com赛默飞官方微信 应用文档64971 采用 TSQ Altis 三重四极杆质谱仪对血浆中的候选药物混合物进行灵敏、耐用的定量分析 Keeley Murphy、Simon Szwandt 和 Claudia Martins Thermo Fisher Scientific， 圣何塞，加利福尼亚 关键词抗抑郁药， LC-MS/MS，TSQ Altis MS，制药，小分子，生物分析，生物等效性 目的 为检测和定量人血浆中目标制剂混合物开发一种灵敏、耐用和可重现的 LC-MS/MS 分析方法。 前言 在大多数制药企业中，小分子候选药物作为新化学实体或仿制药，占据了药物发现管道的大部分比例。目标定量分析是最佳工作流程的一个关键组成部分，其要求成功开发出小分子药物。而这些目标定量分析必须在生物基质中完成，因此，常常带来分析挑战。在本项研究中，我们报道了为大鼠血浆中多个药物标准品开发的灵敏、耐用、可靠和可重现的LC-MS/MS 分析方法。 样品制备 采用乙乙(ACN)： 血浆=3：1破坏血浆，从而制备已破坏的血浆储备液。将制备的溶液在 10，000 rpm 下离心 10分钟。去除上清液，并加入等体积的水，最终得到已破坏血浆的储备原液。将已破坏血浆储备混合液中每种标准化合物浓度为 1 mg/mL 的储备液稀释至 1 pg/mL-25，000 pg/mL 和 10 pg/mL-100，000 pg/mL。将同位素标记的内标化合物加入到每个校正水平上，从而得到最终浓度为 0.5ng/mL 的内标溶液。所有试剂均购自 Cerilliant 公司(朗德罗克，得克萨斯州)，浓度为 1 mg/mL 的甲醇溶液。 液相色谱法 采用 Thermo Scientific M VanquishM Horizon HPLC 系统进行色谱分离。所使用的色谱柱为 Thermo ScientificMHypersil GOLDM aQ C18 极性封端 LC 色谱柱(100×2.1mm， 1.9 um 粒径)。流动相A和B分别为10mM 甲酸铵水溶液(采用 Fisher ChemicalM OptimaM级纯水)和0.1%甲酸乙腈溶液。柱温为50℃。总运行时间为3.5分钟(表1)。 表1.分析方法的色谱梯度 时间 (min) 流速 (mL/min) %A %B 0 0.6 95 5 0.4 0.6 95 5 0.5 0.6 65 35 1.5 0.6 64 36 1.6 0.6 55 45 2.2 0.6 53 47 2.3 0.6 5 95 2.95 0.6 5 95 2.995 0.6 95 5 3.5 0.6 95 5 质谱分析法 采用 Thermo ScientificM TSQ AltisTM三重四极杆质谱仪进行质谱分析，配置 Thermo ScientificTM OptaMaxM NG 离子源室。表2和表3显示了实验设置中使用的质谱仪离子源和 SRM 参数。 表2.质谱仪设置 参数 设置 运行时间 3.5 min 离子源 HESI 喷雾电压 3500V 鞘气 40 Arb 辅助气 15 Arb 吹扫气 0Arb 离子传输管温度 350℃ 雾化器温度 325℃ 实验类型 SRM 循环时间 0.3s 色谱峰宽 6s 碰撞气压力 1.5 mTorr Q1分辨率 0.7 FWHM Q3分辨率 0.7 FWHM 数据分析 采用 Thermo Scientific1MTraceFinderTM软件采集并处理数据。 化合物名称 开始时间 结束时间 极性 母离子 子离子 碰撞能量 射频透镜 (min) (min) m/z m/z (v) 二氢脱氧吗啡 0.760 1.060 正离子 272.062 215.054 26 69 去甲氧西汀 1.230 1.530 w正离子 266.062 107.000 23 56 氟卡尼 1.310 1.610 正离子 415.050 398.054 24 84 咪达唑仑 1.410 1.710 正离子 326.012 291.054 28 87 丙咪嗪 1.660 1.960 正离子 281.462 86.054 17 48 阿米替林 1.800 2.100 正离子 278.075 233.111 18 53 78氟西汀 1.890 2.190 正离子 310.362 43.889 11 39 地西泮 2.230 2.530 正离子 285.012 193.071 33 78 结果与讨论 研究发现，采用 TSQ Altis MS 测得的每个候选药物的定量下限(LLOQ)明显低于采用以前几代 MS 系统的测量值(表4)。此外，内标化合物的%CV值显著降低也意味着 TSQ Altis 质谱的耐用性和重现性更优。300 pg/mL QC 2 的典型色谱图见图1。QC 线性和重现性的更多详细信息见表5. 表4.血浆中候选药物的定量限与内标化合物的%CV(n=3) 化合物 LOQ(pg/mL) 内标化合物的%CV 二氢脱氧吗啡 5 3.5 去甲氧西汀 2.5w 3.5 氟卡尼 1 3.5 咪达唑仑 2.5 4.4 丙咪嗪 2.5 4.4 阿米替林 2.5 4.4 氟西汀 5 5.1 地西泮 2.5 3.4 图 1.QC 2-300 pg/mL的典型色谱图 化合物 QC1%CV QC2%CV QC3%CV QC4%CV R² 30 pg/mL 300 pg/mL 3000 pg/mL 15，000 pg/mL 线性拟合度 二氢脱氧吗啡 7.93 4.72 3.47 1.15 0.9945 去甲氧西汀 5.28 1.55 0.67 1.01 0.9904 氟卡尼 4.20 4.88 2.46 2.97 0.9924 咪达唑仑 2.96 1.52 1.71 2.77 0.9917 丙咪嗪 2.50 1.26 0.38 1.24 0.9913 阿米替林 7.04 3.16 0.68 0.83 0.9908 氟西汀 3.15 2.80 2.03 2.87 0.9901 地西泮 5.77 3.15 0.53 2.69 0.9927 结论 本应用文档中涉及的分析方法在整个分析的动态范围内呈现出优异的线性和重现性。该方法表明， TSQ Altis 质谱提供了药物化合物分析中所需的灵敏度和重现性。     为检测和定量人血浆中目标制剂混合物开发一种灵敏、耐用和可重现的 LC-MS/MS 分析方法。    在大多数制药企业中，小分子候选药物作为新化学实体或仿制药，占据了药物发现管道的大部分比例。目标定量分析是最佳工作流程的一个关键组成部分，其要求成功开发出小分子药物。而这些目标定量分析必须在生物基质中完成，因此，常常带来分析挑战。在本项研究中，我们报道了为大鼠血浆中多个药物标准品开发的灵敏、耐用、可靠和可重现的 LC-MS/MS 分析方法。    应用文档中涉及的分析方法在整个分析的动态范围内呈现出优异的线性和重现性。该方法表明，TSQ Altis 质谱提供了药物化合物分析中所需的灵敏度和重现性。