血液制品是指各种人血浆蛋白制品,包括人血白蛋白、人胎盘血白蛋白、静脉注射用人免疫球蛋白、肌注人免疫球蛋白、组织胺人免疫球蛋白、特异性免疫球蛋白、乙型肝炎、狂犬病、破伤风免疫球蛋白、人凝血因子Ⅷ、人凝血酶原复合物、人纤维蛋白原、抗人淋巴细
胞免疫球蛋白等。血液制品的原料是血浆。
2 3 曾海龙余翀天赛默飞世尔科技(中国)有限公司 关键词:血液制品;磷酸三丁酯;气相色谱。 目标:本文基于文献报道和药典方法《中国药典》2010年版第三部附录VIJ“磷酸三丁酯残留量测定法”,建立了以毛细管色谱柱TG-WAXMS(30mx0.25mm×0.25um)分析血液制品中磷酸三丁酯气相色谱法测定条件,以满足该行业客户群分析检测需求。 引言 血液制品是指各种人血浆蛋白制品,包括人血白蛋白、人胎盘血白蛋白、静脉注射用人免疫球蛋白、肌注人免疫球蛋白、组织胺人免疫球蛋白、特异性免疫球蛋白、乙型肝炎、狂犬病、破伤风免疫球蛋白、人凝血因子Ⅷ、人凝血酶原复合物、人纤维蛋白原、抗人淋巴细胞免疫球蛋白等。血液制品的原料是血浆。人血浆中有92%-93%是水,仅有7%-8%是蛋白质,血液制品就是从这部分蛋白质分离提纯制成的。国内有血液制品生产企业三十四家,正常开工的二十多家,年处理血浆量在100吨以上的仅十余家。磷酸三丁酯作为病毒灭活剂广泛使用于血液制品业中,因此建立磷酸三丁酯的残留检测方法是非常有必要的。 磷酸三丁酯化学分子结构式 磷酸三丁酯,中文代号TBP,中文别名:磷酸三丁酯、三丁基磷酸盐、磷酸正丁酯、三正丁基磷酸盐、磷酸三丁脂、磷酸三正丁酯、三丁基磷酸盐、磷酸三丁酸,分子式C12H27O4P; OP (OCH,CH,CH,CH3)、分子量 266.32。外观与性状:无色、有刺激性气味的液体;蒸汽压:2.67kPa/20℃;沸点::(180-183)℃(2.87 kPa);闪点:146℃(开口);熔点<-79℃;表面张力:27.79 mN/m(20℃);难溶于水,水中溶解性为 0.1%(25℃)。能与多种有机溶剂混溶;密度相对密度(水=1(0.9766;木对密度(空气=1)7.67;稳定;危险标记: R36/38 Irritant。健康危害:本品对人血、血浆中胆碱酯酶有轻度抑制作用。人经口,约100毫升,可引起呼吸困难、抽搐、麻痹、昏睡等症状。对皮肤有刺激作用。蒸气和烟雾对眼睛、粘膜和上呼吸道有刺激作用。接触后可引起中枢神经系统的刺激症状。 有毒理学资料如下: (1)毒性:对皮肤和呼吸道有强烈的刺激作用,具有全身致毒作用。。(2)急性毒性:LD503000 mg/kg(大鼠经口); LC501.3g/m,6小时,(实验大鼠三只吸入)无死亡;人经口约100mL可引起呼吸困难、抽搐、麻痹、昏睡等症状。(3)亚急性和慢性毒性:豚鼠经皮1mL/kg/日×4日,2/3死亡。 目前关于磷酸三丁酯的检测方法有气相色谱法-FID(1-5]和气相色谱质谱法同,标准方法有GB/T15354-2011、药典方法《中国药典》2010年版第三部附录VIJ“磷酸三丁酯残留量测定法”旧。而用于分析磷酸三丁酯的色谱柱报道中主要有TM-FFAP柱、DB-WAX柱、PEG-20M、HP-5和HP-INNOWax。本实验采用毛细管色谱柱TG-WAXMS(30mx0.25 mmx0.25um), 优化了初始柱温、进样口温度、检测器温度和升温速率等条件,建立了血液制品中磷酸三丁酯的气相色谱-FID检测器的测定方法,以磷酸三丙酯为内标,采用内标法定量。 ( 仪器 ) ( Thermo ScientificTM TRACE 1310气相色谱仪,配FID 检测器,包括: ) -配分流/不分流进样口 ( -AS/AL1310 自动进样器 ) Thermo Scientific Dionex ChromeleonTM 7 Version7.2.1.5833数据处理系统 Thermo ScientificTM毛细管色谱柱TG-WAXMS(30mx0.25mm×0.25um) ( P/N 26088-1420) Thermo ScientificTM不分流衬管(P/N 453A1925) Thermo Scientific TM低流失进样口隔垫(P/N31303233) Thermo ScientificTM气相色谱进样口石墨垫(P/N290GA139) Thermo Scientific TM 15mL塑料离心管(P/N339650) Thermo ScientificTM 2mL进样小瓶(P/N C4000-88W) Thermo ScientificTM 2mL进样小瓶样品架(5×10,C4012-25) Thermo ScientificTM 10~100pL移液器 (JH91538) Thermo Scientific TM 100~1000pL移液器(JH91348) 试剂与标准品 磷酸三丁酯AR分析纯(济宁铭达新材料有限公司),纯度≥99%,磷酸三丙酯AR分析纯(北京华业寰宇化工有限公司),纯度≥99%,正己烷(CH(CH2)4CH), HPLC 级(Fisher Scientific UN1208)。 标准溶液的制备 取磷酸三丁酯(99%以上),精密称定,用正己烷稀释成浓度30mg/mL的磷酸三丁酯标准液,备用。 内标溶液的制备 取磷酸三丙酯(99%以上),精密称定,用正己烷稀释成浓度10mg/mL的磷酸三丙酯内标液,作为内标备用。 标准工作曲线溶液的制备 精密量取磷酸三丁酯标准液10pL、20uL、40pL、60uL、80uL,分别置已精密加水3mL的具塞玻璃离心管中,再分别精密加磷酸三丙酯内标液50pL, 振荡1 min,再加正己烷4mL, 振荡2 min, 以每分钟3500转离心5min。小心吸取上层正己烷,供气相色谱仪分析。 精密量取供试品3mL,置具塞玻璃离心管中,精密加磷酸三丙酯内标液50uL,振荡1min,再加正己烷4mL,振荡2min,以每分钟3500转离心5 min。小心吸取上层正己烷,供气相色谱仪分析。 制备方法同上,精密量取蒸馏水3mL,置具塞玻璃离心管中,分别添加入10pL、20pL、40pL三个水平标准品,各做6个平行样品,精密加磷酸三丙酯内标液50pL, 振荡1min, 再加正己烷4mL, 振荡2min, 以每分钟3500转离心5 min。小心吸取上层正己烷,供气相色谱仪分析。 GC条件 色谱柱: Thermo Scientific TM TG-WAXMS(30mx0.25mmx0.25pm, PN:26088-1420) 升温程序:60℃(2 min), 25C/min to 240℃(3min); 进样口: 进样口温度为240℃;不分流进样; FID检测器:检测器温度为240℃;空气:350mL/min;氢气:35mL/min;氮气:40mL/min。 载气: 高纯氦气(99.999%),恒流模式,流速:1.2mL/min。 结果与讨论 气相色谱条件的建立 :1))初始柱温的优化 配置磷酸三丙酯(内标)和磷酸三丁酯浓度分别为125pg/mL、600pg/mL的混标溶液。磷酸三丙酯比磷酸 图B 图1.不同初始柱温 三丁酯先出峰,设定不同初始柱温,分别为:40、50、60、80、100、120和140℃。其他气相色谱条件一致,考察初始柱温对色谱图的影响,从图1可以看出,温度从40~140℃,通过比较峰高、峰型、分离度和分析时间等因素,40>60>50>80>100>120>140,当温度从100℃时,峰型开始变形分叉,所以最终选择初始柱温为60℃。 2))不同进样口温度的优化 同上,初始柱温为60℃,其他气相色谱条件相同,设定不同进样口温度,分别为:150、160、170、180、190、200、210、220、230和240。考察不同进样口温度对色谱图的影响,从图2可以看出,随着进样口温度的升高,磷酸三丙酯和磷酸三丁酯的响应呈逐渐上升的趋势,当温度为240℃时,磷酸三丁酯变化最明显,响应超过磷酸三丙酯,所以选择进样口温度为240℃。 图2.不同进样口温度 3)不同检测器温度的优化 同上,初始柱温为60℃,进样口温度为240℃,其他气相色谱条件相同,设定不同检测器温度,分别为:200、210、220、230、240和250℃。考察不同检测器温度对色谱图的影响,从图3可以看出,除230℃外,从200~250℃,随着检测器温度升高,响应呈先上升后趋于平稳,240℃时略大于220℃,因此,选择240℃作为检测器的最佳温度。 图3.不同检测器温度 4))不同升温速率的优化 同上,初始柱温为60℃,进样口温度为240℃,检测器温度为240℃,其他气相色谱条件相同,设定不同升温速率,分别为:15、20和25℃/min。考察不同升温速率对色谱图的影响,从图4可以看出,峰高顺序是25>20>15,所以选择升温速率为25℃/min。 图4.不同升温速率 综上所述,初始柱温为60℃、进样口温度为240℃、升温速率为25℃/min、FID检测器温度为240℃。 图5.标准溶液色谱图 (磷酸三丙酯为125ug/mL,磷酸三丁酯浓度为150pg/mL) 图6.添加溶液色谱图 (磷酸三丙酯为125pg/mL,磷酸三丁酯浓度为150pg/mL) 图7.空白色谱图 (磷酸三丙酯为125ug/mL,磷酸三丁酯浓度为Oug/mL) 图8.样品色谱图 线性、检出限及RSD 配置标准溶液工作曲线,各浓度分别为:75.0、150.0、300.0、450.0和600.0 ug/mL, 内标浓度为125ug/mL, 考察组分的线性。实验结果表明TBP在75.0~600.0pg/mL线性关系良好,相关系数0.9998,标准工作曲线见图7。对75.0pg/mL标准品连续进样6针,RSD在1.14之间,重复性良好。该方法中仪器检出限为7.50ug/mL (S/N>10)(见表1)。 表1.线性及检出限数据 化合物 线性范围 相关系数 检出限 RSD (pg/mL) (pg/mL) (%) TBP 75~600 0.9998 7.50 1.14 加标回收率实验 加标回收率实验,添加量分别为75.0、150.0、300.0pg/mL,三水平6平行进行测试。实验结果表明加标回收率在81.43~100.20%之间,符合分析检测的要求(表2)。 图9.标准工作曲线 结论 本文基于文献报道和药典方法《中国药典》2010年版第三部附录VJ“磷酸三丁酯残留量测定法”。建立以毛细管色谱柱TG-WAXMS(30mx0.25mm×0.25um)分析血液制品中磷酸三丁酯气相色谱法测定条件,优化了初始柱温、升温速率、进样口温度和检测器温度。最佳色谱条件为:初始柱温为60℃、进样口温度为240℃、升温速率为25℃/min、FID检测器温度为240℃。实验结果表明TBP在75.0~600.0 pg/mL线性关系良好,相关系数0.9998,对75.0pg/mL标准品连续进样6针, RSD值为1.14%,重复性良好。该方法中仪器检出限为7.50 pg/mL(S/N>10)。加标回率率实验,添加量分别为75.0、150.0、300 .0pg/mL, 三水平6平行进行测试,实验结果表明加标回收率在81.43~100.20%之间,符合分析检测的要求。 表2.加标回收实验结果 添加浓度 回收率(%) 平均值 相对标 (pg/mL) 1 2 3 4 5 6 准偏差 75 87.98 94.69 81.43 90.89 92.49 86.14 88.94 5.38 150 100.10 94.22 94.22 100.20 92.77 94.24 95.96 3.43 300 95.63 93.46 99.97 94.98 96.04 98.27 96.39 2.44 ( [1] 吴骥宇,曹文,陈睿,刘惠军.毛细管气相色谱法测定糜蛋白酶中磷酸三丁酯残留量[J],中国临床药学杂 志,2013,06. ) ( [2]刘婷婷,徐琛,陈益乐,等.气相色谱法测定医用纤维蛋白胶制品中磷酸三丁酯残留量[J],中国临床药学 杂志,2011,04. ) ( [3]王伟,陈智岩.气相色法法测定冻干纤维蛋白胶制品中磷酸三丁酯残留量[J],黑龙江中医药,2009. ) ( [4]盛凤仙.冻干人纤维蛋白胶制品中磷酸三丁酯残留量的气相色谱法测定[J],中国医药工业杂 志,2002,03. ) ( [5]王传化.气相色谱校正曲线法快速测定磷酸三丁酯 含量[J],磷肥与复肥,2013,06. ) ( [6]易勇,刘克清,张浩,等.气相色谱-质谱法分析固井 水泥浆添加剂中磷酸三丁酯[J],分析仪器,2014,04. ) ( [7] GB/T15354-2011化学试剂磷酸三丁酯. ) ( [8]2010中国药典第三部附录VJ“磷酸三丁酯残留 量测定法”. ) 免费服务热线:88008105118 ThermoFisherSCIENTIFIC 支持手机用户) 本文基于文献报道和药典方法《中国药典》2010年 版第三部附录VI J“磷酸三丁酯残留量测定法”。建立以 毛细管色谱柱TG-WAXMS(30 m×0.25 mm×0.25 μm) 分析血液制品中磷酸三丁酯气相色谱法测定条件,优 化了初始柱温、升温速率、进样口温度和检测器温 度。最佳色谱条件为:初始柱温为60 ℃、进样口温度 为240 ℃、升温速率为25 ℃/min、FID检测器温度为 240 ℃。实验结果表明TBP在75.0~600.0 μg/mL线性关 系良好,相关系数0.9998,对75.0 μg/mL标准品连续进 样6针,RSD值为1.14%,重复性良好。该方法中仪器检 出限为7.50 μg/mL(S/N>10)。加标回收率实验,添加 量分别为75.0、150.0、300 .0 μg/mL,三水平6平行进 行测试,实验结果表明加标回收率在81.43~100.20%之 间,符合分析检测的要求。
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赛默飞色谱与质谱为您提供《血液制品中磷酸三丁酯残留量检测方案(气相色谱仪)》,该方案主要用于全血/血清/血浆中生化检验检测,参考标准--,《血液制品中磷酸三丁酯残留量检测方案(气相色谱仪)》用到的仪器有Thermo Scientific 气相色谱仪 TRACE 1300系列